CAMP-PKA信号转导途径在预处理心肌保护机制中的研究.docVIP

cAMP-PKA信号转导途径在预处理心肌保护机制中的研究 薛庆华 扬静 程卫平 李立环* 北京阜外心血管病医院 [摘要] 目的：探讨cAMP-PKA信号转导途径是否介入了预处理心肌保护作用及其可能的机制。方法：50只SD大鼠随机分为缺血/再灌注（I/R）组、缺血预处理（IPC）组、H89（PKA抑制剂）组、脯氨酸二硫氨基甲酸（PDTC，NF-κB抑制剂）组和db-cAMP组。建立大鼠离体心脏Langendorff灌注模型，I/R组在平衡40min后，阻断1h复灌30min；IPC组在平衡10min后，阻断5min、再灌5min，循环3次，随后阻断1h复灌30min； H89组和PDTC组在缺血预处理期分别用含有H89（10μM）和PDTC（100μM）的K-H液灌注；db-cAMP组平衡10min后，用含db-cAMP（200μM）的K-H液灌注30min。在平衡期、复灌10min、20min和30min记录左室压力变化率（±dp/dtmax) 、左室发展压（LVDP）；平衡期和复灌30min时记录冠脉流量（CF），测定冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）含量；复灌30min后留取心肌组织保存于液氮中。用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测p-CREB（Ser133）含量，凝胶电泳迁移率法（EMSA）检测NF-κB-DNA结合活性，Real-time PCR检测TNF-αmRNA的表达。结果: 1、IPC和db-cAMP组p-CREB（Ser133）的表达显著高于I/R（P 0.01），H89可抑制IPC所致的CREB（Ser133）磷酸化（P 0.01）；2、IPC和db-cAMP组NF-κB-DNA结合活性、TNF-α mRNA表达明显低于I/R组（P 0.01），H89和PDTC可削弱IPC的作用（P 0.05）；3 、I/R、H89和PDTC组复灌期间±dp/dtmax 、LVDP以及CF均明显低于基础值，在复灌20min和30min时显著低于IPC、db-cAMP组（P 0.01或P 0.05）；4、复灌30min 5组冠脉流出液中CK和LHD活性均有升高，I/R组、H89和PDTC组显著高于各自基础值和IPC、db-cAMP组（P 0.01, P 0.05）。 结论：db-cAMP预处理的心肌保护作用与IPC相似。可能是通过cAMP-PKA信号转导途径降低NF-κB-DNA结合活性、减少炎性因子基因转录而具有减轻心肌缺血再灌注损伤的心肌保护作用。 关键词： cAMP-PKA；预处理；核因子-?B（NF-?B）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α） 1986年，Murry[1]提出缺血预处理（ischemia preconditioning，IPC）的概念，即反复短暂缺血和再灌注可以提高组织对随后较长时程缺血缺氧的耐受性，其保护作用已在多种属动物的在体、离体心脏和心肌细胞上得到证实。已明确的具有心肌保护作用的预处理有内源性和外源性两种机制，迄今为止IPC被认为具有最强的内源性保护作用，但由于缺血的最佳时间、安全时限及个体差异等问题使其临床应用受到限制，因此众多学者期望通过研究预处理机制，尝试着能否用药物激活预处理通路，避免心肌的预缺血过程而取得心肌保护作用。研究提示蛋白激酶C（protein kinase C）介导了IPC，然而围绕其研制的预处理药物仅局限于实验研究。近来研究观察到短暂缺血前应用β-R受体激动剂、腺苷酸环化酶激活剂、磷酸二脂酶抑制剂III等可增加cAMP并快速激活PKA的药物在体内均具有不依赖于PKC的心肌保护作用[2,3]。因而cAMP-PKA信号转导途径在预处理心肌保护机制中的作用引起了心脏病学界的极大兴趣。 具有多种炎性因子基因转录调节功能的核转录因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）介导了心肌缺血再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，MI/R）损伤[4,5]。预处理能否通过增加cAMP，激活PKA 继而抑制NF-κB活化、抑制炎性反应而具有心肌保护作用的研究国内外未见报道。本研究通过建立大鼠离体心脏Langendorff灌注模型，实施缺血、db-cAMP预处理并给予PKA抑制剂H89和NF-κB抑制剂PDTC干预，观察心脏I/R后心功能和生化指标的变化，以期揭示预处理心肌保护中cAMP-PKA信号转导途径与NF-κB活化和炎性反应的关系，为临床寻找新的防治措施提供思路。 1、材料与方法 1.1、 材料：健康雄性SD（Sprague-Dawl）大鼠，体重300～350g，由中国医学科学院阜外心血管病医院实验动物中心提供。PKA抑制剂H89（美国Biosource公司）；NF-κB抑制剂脯氨酸二硫代氨基甲酸脂（P