基因工程载体文档.doc

第三章 基因工程载体 体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 基因工程中3种主要类型的载体： 1.质粒载体 2.噬菌体载体 3.柯斯质粒（cosmid）载体 基因工程对载体的要求 （1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。 （3）有一段多克隆位点。 外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。 第一节 质粒(plasmid)载体 质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。 (一)质粒的构形 环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型： 共价闭合环形DNA（cccDNA） 开环DNA（open circular,ocDNA） 线形DNA（linear,lDNA） （二）质粒的转移性 指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。 接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求。 非接合型质粒： 带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。 符合基因工程的安全要求。 R质粒： 带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。 Col质粒： 细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。 带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。 Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。 某些非接合型质粒（Col E1）在接合型质粒的存在和协助下也能DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。 （三）质粒的复制类型 1.严紧型质粒（stringent plasmid）低拷贝数 ，有1~3份的拷贝；（接合型质粒分子量大，一般属严紧型） 2.松弛型质粒（relaxed plasmid）高拷贝数，10~200份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型） 松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的控制，因此，当用蛋白质合成抑制剂氯霉素（Cml）处理寄主细胞，使大肠杆菌染色体DNA复制受阻时，松弛型质粒DNA仍可继续扩增（氯霉素抗性质粒例外）。而严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格限制，其拷贝数不能通过用氯霉素来增加，对于有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝数的质粒载体。 高拷贝数的质粒载体 Col E1、pMB1派生质粒, 而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数1000~3000个！ 适合大量增殖克隆基因或需要表达大量的基因产物。 低拷贝数的质粒载体 pSC101派生的载体, pLG338、pLG339、pHSG415等,不适合大量扩增DNA用。 但当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。 大多数的质粒载体都有一个来源于pMB1质粒的复制子，而且使用抗菌素抗性记号，主要有： 四环素抗性（Tetr） 氨苄青霉素抗性（Ampr） 链霉素抗性（Strr） 卡那霉素抗性（Kanr） 氯霉素抗性（Cmlr） 抗菌素抗性记号具有便于操作，易于选择等优点。 （四）质粒的不亲和性： 实验观察表明，同一个大肠杆菌细胞中，在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒一般是不能够同时共存的，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这种现象就是质粒的不亲和性。两种质粒彼此之间互不相容，这样的质粒属于同一个不亲和