16SrDNA鉴菌株的标准操作规程.docVIP

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在?16S rRNA?分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。 由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。 16SrDNA 16SrDNA 27F 27F 519R 519R 357F 357F 1115R 1115R 926F 926F 1492R 1492R 3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。 设备和材料 器材 移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130 试剂 DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit； 耗材 移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro AmpTM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro AmpTM Optical Adhesive Film； 引物 16SrDNA 名称 序列 扩增长度 第1部分 正向引物27F 5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 500 bp左右 反向引物519R 5- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3 第2部分 正向引物357F 5- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3 750bp左右 反向引物1115R 5-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3 第3部分 正向引物926F 5- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3 560 bp左右 反向引物1492R 5-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3 其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 序列比对测序反应产物纯化基因扩增核酸提取操作流程 序列比对 测序反应 产物纯化 基因扩增 核酸提取 实验方法 核酸提取： 挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min后，以离心机最大转速离心3min，取10μL上清液与490μL ddH2O（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。提取的DNA于-20℃保存。 基因扩增 PCR反应体系 试剂 使用量（25μL体系） 模板DNA 2μL（10ng~100ng） Taq酶(5U/μL) 0.2μL 10×Taq Buffer(Mg2+) 2.5μL dNTPs(各2.5mM) 2μL 引物F(1μM) 5μL 引物R(1μM) 5μL ddH2O 8.3μL 备注：DNA模板量通常在100 ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的D