包涵体变复性技术研究进展.pdf

290 中国医药生物技术 2012 年 8 月第 7 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 2012, Vol. 7, No. 4 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.008 ·综述· 包涵体变复性技术研究进展 罗莉，李坤，王保成，王明蓉 现代生物技术的迅猛发展使大规模表达异源重组蛋白 pH 值（通常为 12.5 ，过高可能引起蛋白降解）的变性液对 成为现实，这极大地促进了蛋白类产品的开发，尤其是重组 rhG-CSF 包涵体蛋白的溶解和复性的影响，认为高 pH 环 蛋白药物的研发。目前非糖基化的重组蛋白表达多采用大肠 境能有效溶解该蛋白，低浓度的尿素具有协同作用，并且 杆菌的原核表达系统，该系统的突出特点是表达产物多以包 2 mol/L 尿素加高 pH 值的条件没有破坏蛋白二级结构，又 涵体形式存在。与蛋白可溶性表达相比，包涵体具有产量高、 能有效减少聚集体的形成，因而更有利于蛋白的复性。另外， 蛋白稳定、容易纯化等优点，对毒性蛋白制备尤其适宜。因 Singh 等[3]研究了含有不同羟基的醇类，如甲醇、乙醇、丙 此，采用包涵体形式已成为规模制备重组蛋白产品的主要途 醇、乙二醇、丙三醇、丁醇对 hGH 包涵体蛋白的溶解，认 径之一。 为 6 mol/L 正丙醇加 2 mol/L 尿素的溶解效果最好。虽然 包涵体形成的原因普遍认为主要是外源蛋白在细胞内 此条件溶解的蛋白量比用尿素、盐酸胍强变性剂溶解的蛋白 的高表达使蛋白合成速度过快，没有时间形成正确折叠；另 量少，但此法溶解的蛋白复性率较后两者高，推测可能与该 外原核表达系统由于缺乏蛋白翻译后修饰，也容易形成包涵 包涵体蛋白在这种非变性条件下仍保有类天然态的二级结 体；培养条件如温度、pH 值、培养基成分等也是影响包涵 构有关。 体形成的因素。由于包涵体绝大多数是不溶的，没有生物活 1.2 变性方法的改进 性的，因而需要经过蛋白质变性-复性的过程以恢复其生物 包涵体蛋白的溶解通常采用一步变性法，即用含有高 活性。目前重组蛋白变复性过程中的技术难点主要在提高蛋 浓度的盐酸胍或尿素的变性溶液一次变性。2005 年，Wang 白浓度和生物活性两方面，而寻找高效、快速、低成本的变 等[4]采用两步变性法对 hIL-2/GM-CSF 包涵体蛋白进行 复性方法是该领域研究的重点。随着重组蛋白产品研发的异 变复性研究。首先用 7 mol/L 盐酸胍进行第一次变性（也 军突起，包涵体变复性技术的研究再次成为了国内外关注的 可用含 L- 精氨酸的碱性溶液代替盐酸胍进行第一次变 焦点。 性[5] ），变性后包涵体中错误折叠的蛋白被完全展开，然后 用 10 mmol/L HCl 透析除去变性液，蛋白重新聚集，再用 1 包涵体的变性 8 mol/L 尿素溶解，这样得到的蛋白溶液在之后的复性过程 包涵体因具有高密度（1.3 mg/ml）和高抗剪切力，在 中更有可能形成正确结构。而且经历了一次变性析出过程 变性前常采用高压匀浆或超声的方法破碎细菌，然后再洗涤 后，目的蛋白的纯度更高，有利于提高复性效率。2011 年 除去破碎后样品中含有的脂类、杂蛋白、核酸、脂多糖等杂 Yang 等[5]对这种两步变性一步复性方法（two-step-denaturing 质。经过洗涤的包涵体，需要进一步加入变性溶液，以破坏 and refolding method，2DR ）在蛋白变复性中