病毒分离培养.ppt

细胞培养技术 第一节 标本的采集和处理 标本的采集 从病原体入侵部位取材:流感病毒取咽喉拭子 从病原体感染的靶器官取材:HIV患者取血 从病原体排泄途径采集:HAV、HEV及轮状病毒 从环境取材：空气、水、土壤、生物材料等 采集原则： 早期采集 采集标本： 血液、尿液、胃液、精液、脑脊液、分泌物 环境标本、媒介生物 标本的运送与储存 注意事项 标本采集后尽快送检 不能及时检验，应注意保存 不怕冷的标本温度越低越好 血液标本等4℃保存 采集标本时注意防护，避免被感染 标本的处理 鼻咽等拭子标本的处理： 加1000U/ml的青霉素和链霉素处理后再离心 血液标本的处理 需抗凝血，离心后取血浆 粪便标本 加10000U/ml的青霉素和链霉素处理，过夜后加适量Hanks液和石英，使病毒充分释放，离心后取上清 标本的处理 尿液标本的处理 加1000U/ml的青霉素和链霉素处理， 4℃作用4h 脑脊液标本的处理 组织标本的处理 先剪成碎块后再匀浆，再按粪便标本方法处理 生物标本的处理 类似组织标本 水体标本 第二节 病毒的分离 组织培养法（tissue culture） 定义：是指将机体（包括人和动物）组织或细胞，在体外模拟机体内生理条件，使之生存或分裂繁殖 常用细胞培养法 组织培养法的种类 原代细胞培养（primary cell culture） 来源人的胚胎组织或正常组织，敏感性强，但只能传几代 常见的原代细胞：人胚肺、人胚肾、人胚肝、鸡胚、地鼠肾、地鼠肝、猴肾等 组织培养法 二倍体细胞培养（diploid cell culture） 定义：是指染色体仍保持二倍体特性，染色体总数为46条，缺点：一般只传50代 许多病毒对它敏感，可用于分离病毒和疫苗生产 常见的有：WI-38、WI-26 传代细胞（continuous cell） 由原代细胞连续传代或肿瘤细胞培养所建立的 常见的有：BHK21（传代地鼠肾）、HeLa（宫颈癌）、Vero（传代非洲绿猴肾）、A549（人肺癌） 鸡胚接种法 应用 某些病毒分离鉴定 流感病毒、副粘病毒、疱疹病毒、痘病毒 可作为体外细胞培养材料 不同病毒接种在鸡胚的不同部位 绒毛尿囊膜接种 选10~12天的鸡胚，增殖后形成清晰的斑点状或痘疱 如天花病毒、新城疫病毒、单纯疱疹病毒、VZV、狂犬病毒等 鸡胚接种法 尿囊腔接种 先在绒毛尿囊膜的内胚层增殖，并释放病毒至尿囊液 可用血凝试验和血凝抑制试验等鉴定 常见的病毒：流感病毒、流行性腮腺炎病毒、东方马脑炎病毒 羊膜腔接种 流感病毒、流行性腮腺炎病毒等，收集羊水 卵黄囊接种 动物接种法 动物的选择 动物的易感性:选择动物首要条件 动物的健康状况: 动物的品系:纯系动物较好 动物的性别、年龄、体重 年龄、体重适中的动物，小鼠18~22g，家兔1.8~2.5g 分离乙脑病毒需要乳鼠，鉴定病毒选雄性动物，制备抗体选雌性动物 动物接种法 动物的接种 脑内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、角膜、皮肤等 病毒的采集 动物的血液检测抗体 分致死性和非致死性采血，采血前应空腹 采血方法：心脏采血、颈静脉采血、颈动脉采血、耳静脉采血、眼眶采血等 动物接种法 动物实验注意事项 动物实验必须达到相应的安全等级 SARS—BSL-3级；埃博拉病毒在BSL-4级 最好操作者接种疫苗，穿好防护服，预防感染 注意防止病毒扩散和污染环境，应彻底消毒和灭菌 应注意动物本身携带的病毒如鼠脑脊髓炎病毒 分子生物学技术；克隆全基因，表达病毒颗粒 物理法 第三节 病毒的鉴定 初步鉴定 根据临床表现、流行特征与标本来源 如夏秋季节从脑炎患者脑脊液分离，考虑乙脑 东北林区从脑炎患者脑脊液分离，先考虑森林脑炎 秋季从腹泻病人粪便分离病毒，先考虑轮状病毒 从发烧小儿粪便分离病毒，出现下肢瘫痪，先考虑脊髓灰质炎 初步鉴定 生物学特性 细胞病变效应（CPE） 细胞融合产生多核巨细胞，如流感、副流感、腮腺炎、疱疹等 出现巨大细胞：在人胚肺考虑巨细胞病毒 细胞圆缩、变小：肠道病毒 细胞肿大，聚集成葡萄状：腺病毒 初步鉴定 血凝现象和血吸附 血凝现象：如流感病毒、风疹病毒的HA 血吸附现象：新城疫病毒能吸附和凝集豚鼠红细胞 病毒干扰现象： 一种病毒感染细胞后，可以干扰另一种病毒在细胞内的增殖 如鼻病毒可吸附人或豚鼠红细胞，如先接种仙台病毒则干扰鼻病毒的增殖，不能吸附红细胞 初步鉴定 理化特性 核酸类型鉴定： 一组加抑制DNA增殖的药物5-氟脱氧尿苷，另一组不加 若病毒增殖明显抑制的属DNA病毒，反之属RNA病毒 脂溶剂敏感试验： 乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等破坏病毒包膜而失去感染性 乙醚鉴定法：用乙醚处理后的试验组跟对照组同时测定病毒滴度，若滴度下降明显（2个对数值），说明对乙醚敏感，属于包膜病毒 初步鉴定 耐酸性试验：鉴别肠道病