不同连接肤的双价单链抗体基因的构建及表达.pdfVIP

细胞生物学杂志 Chinese Jouma1 of Cell Bio1ogy 2007 , 29: 272-276 不同连接肤的双价单链抗体基因的构建及表达 严丹丹1 ， 2 方瑾1* 宋今丹l (中国医科大学细胞生物学教研室，卫生部细胞生物学重点实验室，沈阳110001; 2沈阳医学院免疫教研室，沈阳110034) 摘要 采用基因重组技术分别借助不同长度的连接肤[G S 和(G S)3]，将两个相同的抗人大 4 4 肠癌单链抗体基因 ND-lscFv 共价连接，构建表达载体pET-28a(+ )ND-l SC(FV)2 并在大肠杆菌 BL21 中表达ND-lsc(Fvh 的融合蛋白。应用 NF+ 亲和层析方法对表达产物进行纯化， SDS、免 疫荧光法 (IFA) 和ELISA对纯化后的蛋白质进行纯度和免疫活性分析。结果表明成功构建了表达 载体pET-28a(+ )ND-l sc(Fvh，并在大肠杆菌中获得高效表达，其表达产物以不溶性包涵体形式存 在。纯化后 ND-lsc(Fv)2-5 ， ND-lsc(Fvk15 的蛋白质纯度分别为 90% 和 86%0 IFA 及ELISA 结果 表明，二者均保留了亲本抗体的免疫活性，对表达在人大肠癌细胞上的肿瘤相关抗原 LEA 具有特 异结合活性，其免疫活性均明显高于ND-lscFv，其中 ND-lsc(Fvh- 15 的免疫活性更接近于亲本单 抗ND-l ，该抗体有望成为大肠癌临床导向诊断和治疗的理想载体。 关键词 双价单链抗体; ND-l; 连接肤;大肠癌;表达 颈癌上皮细胞株为本室保存;大肠杆菌E.coli JMI09、 利用单克隆抗体作为载体进行导向诊断和治疗 是肿瘤研究的重要课题[1-2] 。基因工程双价抗体作为 E. coli BL21 及pMDI8-T 克隆载体为TaKaRa 公司产 一种新塑的小分子抗体既具有 scFv (single-chain Fv) 品; pET -28a(+ )ND-l scFv 表达质粒由本室构建。 分子量小、组织穿透能力强及免疫原性低等特点， 1.1.2 主要试剂 限制性内切酶SalI 、 HindIII、 又具有类似于完整抗体IgG 的双价结合位点，与scFv EcoRI , Taq DNA 聚合酶均为 TaKaRa 公司产品。胶 相比其抗体的亲和性大大提高，适中的分子量(55-80 回收试剂盒为上海华舜生物公司产品。 T4 DNA 连 kDa) 既保证了抗体在肿瘤组织的良好穿透能力，又大 接酶购自 NEB 公司。 FITC 荧光标记羊抗鼠抗体为 Sigma 公司产品。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗 大改善了 scFv 在体内清除过快的缺点。因此近年来， 人们用scFv 为元件构建出来的基因工程双价抗体分子 体为 Santa 公司产品。抗His-Tag 单抗为 Invitrogen 在肿瘤的显像和治疗方面显示出良好的应用前景[3--4]。 公司产品。 Ni-NTA 亲和层析填料购自 Qiagen 公司。 HisProbe™_HRP 抗体及Western 印迹检测试剂盒 ND-l 是本室以人大肠癌细胞CCL-187 为免疫 原制备的鼠抗人大肠癌单克隆抗体，其与CCL-187细 (HisProbeTM Westem blotting Kit)为民erce 公司产品。 胞表面表达的肿瘤相关抗原LEA 能够特异性结合[坷， ND-l 是本室以人大肠癌细胞CCL-187 为免疫原