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* * * * * 引物设计及评价 引物设计的基本原则： 1) 避免重复碱基，尤其是G. 2) 引物的退火温度要高，一般要在60度以上3）GC=30-80%. 4) 3‘端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C. 5) 正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。 6) PCR扩增产物长度： 不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）. * 引物设计及评价 做溶解曲线Dissociation curve * 引物设计及评价 * SYBR法常见问题及注意事项 特异性扩增产物 非特异性扩增产物 引物二聚体 * 探针设计原则 探针位置尽可能地靠近上游引物，扩增片段长度在50－150bp范围内； 探针长度通常在20－30bp，Tm值在65－70℃，通常比引物Tm高5－10℃，GC含量在40%－70%。 探针的5’端应避免使用碱基G。 探针内部或探针与2条引物之间避免3个碱基以上的互补序列。 * 探针设计原则 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在Blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。 * Primer express 3.0 * * * Thanks for your attention! * Ct值定量的数学原理 × * Ct值定量的数学原理 × * Ct值定量的数学原理 * Ct值定量的数学原理 Threshold 104 103 102 * 靶标基因的定量 * 靶标基因的定量 5000 10000 1 2 需要制备标准品 需制作绝对标准曲线 无需标准品， 需制作相对标准曲线 * 靶标基因的定量 CYP6B6 Actin Northern blot 半定量PCR * 三、绝对定量 * 三、绝对定量 * 三、绝对定量 标准品的一些标准： 必需用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同 标准品必需是经过准确定量的（例如，用分光光度计定量） 标准品必需是标准化的（例如，同一化的细胞数） 在每组实验时，标准品和待测样品必需用相同的阈值来确定Ct值 * 三、绝对定量 标准品的制备方法： 1.化学合成目的基因，优点是纯度高、定量准确 缺点是受化学合成工艺限制，只能合成120bp以下的长度； 2.回收纯化PCR产物后克隆到载体上，然后抽提质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量 优点是稳定、准确。 * 三、绝对定量 标准品倍比梯度稀释方法： 10v原液(标准品i) +90v稀释缓冲液，得标准品ii 10v标准品ii+90v稀释缓冲液，得标准品iii 10v标准品iii +90v稀释缓冲液，得标准品iv 10v标准品iv +90v稀释缓冲液，得标准品v Why? * 三、绝对定量 拷贝数的计算(以dsDNA为例） 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×50×稀释倍数 样本分子量=碱基数×660 dalton/bp 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本质量/样本分子量×6×1014 * 三、绝对定量 拷贝数的计算举例： 3000 碱基质粒，浓度100 ng/ul MW= 3000 bp x 660 dalton/bp =1.98 x 106 daltons。 copy数＝ --------------×6×1014 ＝ 3x 1010 copies/ul 100ng 1.98 x 106 * 绝对定量举例 Copies/ul Ct 1 Ct 2 Meant Ct STD 5×103 28.18 28.64 28.41 0.16 5×104 25.25 25.14 25.19 0.04 5×105 22.11 22.46 22.28 0.12 5×106 18.63 18.92 18.77 0.10 Blank － － 棉铃虫Cyp6B2基因拷贝数检测 * 绝对定量举例 扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 =10-1/-3.18 =2.06 E%=(2.06-1) ×100% =106% * 绝对定量举例 如未知样本Ct为20.5，将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.183 X + 40.211 X=（20.5-40.211）/-3.183 =6.19 未知样本拷贝数=106.19 　　　=1548816 copies/ul * 四、相对定量 无需知道目的基因的绝对拷贝数 需要注意的问题： 1. 模板均一性问题：起始的细胞数、细胞的状态、均一性等 2. RNA制备：RNA纯化得率、均一性等 3. 反转录：反转录的效率等 * 内标/内参照