核酸杂交技术.pptVIP

一、杂交的基本原理 杂交的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待测样品中的病毒核酸,杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号, 则说明样品中存在病毒核酸,进而证明病毒感染的存在。 3、全程RNA探针标记4、化学法全程标记 四、杂交与杂交后检测 （一）核酸分子与固相介质的结合 1、支持介质的类型和性质 硝酸纤维薄膜： 本底低，易检测杂交信号对小于500碱基的 核酸结合力低，脆性大易破裂。 尼龙膜和带电荷的尼龙膜： 耐用，结合力强，但其本底高。 （二）核酸分子的转移 1、噬菌体/克隆的转移 2、从凝胶上转移DNA （1）毛细转移 （2）真空转移 （3）电转移 （三）核酸的固定 1、烘烤 80℃2小时 2、紫外光固定 3、碱固定 （四）杂交 1、预杂交 （1）目的：减少非特异性杂交 （2）成分： 去污剂：1%SDS （可促进溶液对薄膜的覆盖，可 抑制RNase酶活性） 封闭剂：Denhard氏溶液 2、杂交 影响杂交的因素 （1）影响长探针杂交的因素 1）影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素 ◇核酸分子浓度与杂交速率 ◇高浓度双链探针的杂交 ◇碱基组成：探针的Tm高，杂交速率快 ◇盐浓度：离子强度与杂交速率成正比；与杂交稳定性 也成正比。 ◇温度：与杂交速率成正比。 ◇甲醛：可降低Tm值。 ◇错配的核酸序列：错配降低杂交速率。 ◇杂交的加速剂 影响长探针杂交的因素 2）酶联探针 3）杂交反应体积 4）杂交时间 3、洗脱 除去溶液 未反应的探针 与滤膜疏松结合的探针 非特异性结合的探针 （五）杂交信号的检测 放射自显影 非放射性杂化分子的检测 4、点杂交和狭缝杂交 （四）基因芯片技术 是集成化的核酸分子杂交技术。 末端标记法 末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5’端或3’端的一类标记法。? 5’端标记法  3’端标记法 （1）5’端标记法（T4噬菌体多苷酸激酶）  用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5’末端的磷酸基团，使其成为5’-OH，然后在（γ-32P）ATP存在下，经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将γ位上的32P转移到DNA或RNA分子的5’-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均带32P标记。 T4噬菌体多苷酸激酶催化 （2）3’端标记法（大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段） 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段有5’→3’DNA聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但无5’→3’外切酶活性。对残缺3’末端可进行标记。   35kD 76kD 苦草杆菌蛋白酶裂解全酶 5’ 3’外切酶 5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶 5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶 Klenow片段 DNA聚合酶I全酶 五、分子杂交技术 液相杂交、固相杂交、原位杂交、基因芯片（一）液相分子杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。 （二）固相分子杂交 将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的游离探针除去，留在膜上的杂交分子容易被检测，能防止靶DNA的自我复性，故被广泛应用。 1、菌落杂交 用于重组细菌克隆筛选的固相杂交。主要步骤： 菌落平板培养 滤膜灭菌后放到细菌平板上 菌落粘到滤膜上 滤膜放到杂交液中 探针杂交 检测 2、 Southern印迹杂交 膜上检测DNA的杂交技术，1975年由Edwin Southern建立。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。 * *  核酸分子杂交技术与应用 一、核酸分子杂交的基本原理与分类（一）核酸分子杂交的基本原理1、变性（denaturation）（1）定义： 在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。 （2）.引起核酸变性的因素 酸 碱 热 变性剂 （尿素） 有机溶剂 （乙醇）