RNA干扰技术原理及应用.ppt

近几年来通过人工合成反义RNA的基因, 并将其导入细胞内转录成反义RNA，即能抑制某特定基因的表达，阻断该基因的功能，有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。同时也暗示了该方法对肿瘤实施基因治疗的可能性。 * Ｈａｎｎｏｎ研究组从果蝇中成功地分离出能特异切割ｄｓＲＮＡ的ＲＮａｓｅⅢ家族核酸酶(Ｄｉｃｅｒ) * 被RISC切斷的mRNA片段可以被)附著，並進行複製，形成一dsRNA。Dicer酶再對dsRNA進行切割，造出新的雙鏈siRNA。如此不斷循環，便可達到信號擴增的效果 * RNA干扰的原理及其应用 一、RNAi的发现简史 90年代初，Rich Jorgensen和其同事,在对矮牵牛(petunias)进行 研究中有个奇怪的发现:将一个能产生红色素的基因置于一个强启动子后, 导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜 色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多 数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen 将这种现象命名为 共抑制现象(cosuppression), 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都 被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象。 然而，并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中这种共抑制现象被称为“quelling”现象。 What’s more... 1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA (antisense RNA)去阻断秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis.elegans) 的par-1基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA的确能够阻断基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA(sense RNA)作为对照,也同样阻断了基因的表达。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。 反义RNA技术 反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。 由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方 式，最早是在E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的，许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA。 反义RNA技术 根据反义RNA的作用机制可将其分为3类： Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列(Shine-Dalgarno sequence）和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ 降解 Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译； Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。 反义RNA技术的原理 利用基因重组构建人工表达载体,使其体外或体内表达反义RNA,通过碱基互补与靶RNA配对结合,封闭或抑制靶基因的表达,从而对细胞的功能产生影响 这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开———华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首次将双链dsRNA———正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能高效、特异地阻断相应基因的表达 。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链ＲＮＡ已经足够完全阻断同源基因的表达。 后来的实验表明在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。 并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。 后来的实验表明在线虫中注入双链RNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。 RNA 干扰 （RNA interference，RNAi） RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。 二、RNAi现象的普遍性 随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。 RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能