马氏珠母贝抗菌肽的初步分离及抗菌活性分析-水产养殖专业毕业论文.docxVIP

r————————’———————————————————————————————————————————————————————～—— r————————’———————————————————————————————————————————————————————～—— ～ Ill l l Il lll II II I I II III {Y1 933356 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人 承担。 论文作者繇孑久挺 日期：山f悻r月岁p日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者躲亏良赴 导师躲／司0“叼 日期：2力ff年j月岁·日 日期：．2，t1年多月f日 本人已经认真阅读“CALLS高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交 “CALIS高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。回壶途塞握銮 丘进唇i旦圭生i旦=生；旦三生筮盔。 pI 易 论文作者签名：寻文 名 日期：三勿J，年j月岁。日 导日 师期 戤勘∥ ：Ⅳ 厂年j～“ 门月?习 日 ... . ...，、_ ... ..，.? . .， . ? . . ·、‘、?. ·、‘、?  ，、. 马氏珠母贝是我国生产海水珍珠的主要养殖贝类，开展马氏珠母贝抗菌肽的研究有 马氏珠母贝是我国生产海水珍珠的主要养殖贝类，开展马氏珠母贝抗菌肽的研究有 助于揭示马氏珠母贝的免疫机制，发现具有良好活性的新型抗菌药物，提高贝体的健康 水平，改善海水珍珠品质，为珍珠养殖业的持续发展提供保障。本文利用酸性缓冲液制 备马氏珠母贝外套膜和鳃组织的抗菌肽粗提液，利用491制备型电泳槽从粗提液中分离 出含有抗菌活性成分的蛋白类物质，并对分离的抗菌蛋白进行了性质测定、溶血活性检 测和抑菌活性分析。 l、马氏珠母贝组织抗菌粗提液的制备 使用无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)对马氏珠母贝进行浸泡刺激。在冰浴条 件下，分别利用玻璃匀浆器、研钵和IKAT-18组织匀浆机制备马氏珠母贝外套膜和鳃组 织抗菌肽粗提液，采用径向扩散法(Radial DiffusionAssay,RDA)测定粗提液的抑菌活 性。通过加热和冻融的方法，研究确定提高组织粗提液抗菌效果的处理条件。结果表明： 以终浓度为1．0x 106cfu-mL‘1的无乳链球菌对马氏珠母贝刺激14h，马氏珠母贝组织粗提 物抗菌活性无显著变化；马氏珠母贝外套膜或鳃组织抗菌肽粗提物制备时，IKAT-18匀 浆机的匀浆效果要优于玻璃匀浆器和研钵；100℃水浴处理组织粗提物10 min可显著提 高其对溶藻弧菌的抗菌活性；反复冻融则会显著降低外套膜组织粗提物的抗菌效果，因 此，在研究过程中应尽量减少样品的冻融次数。 2、马氏珠母贝抗菌肽的分离与鉴定 根据抗菌物质分子量大小的不同，使用491制备型电泳槽对马氏珠母贝组织中含有 的肽类抗菌物质进行分离。检测分离得到的抗菌物质(PM．AMP．II)后，采用聚丙烯酰 胺凝胶电泳法确定其分子量，利用紫外分光光度计测定抗菌物质中的蛋白浓度。研究结 果表明，利用491制备型电泳槽分离得到了抗菌物质，其中单峰值样品经SDS．PAGE分 析，胶上显示单一条带，分子量为1124Da，该单峰值样品能被蛋白酶K水解，属于小 分子的抗菌蛋白，蛋白含量为2．10mg／mL。 3、马氏珠母贝抗菌成分的抑菌活性研究 为了确定所分离得到的单峰值样品的溶血活性和抑菌效果，使用血琼脂板孔穴扩散 法和液体培养基倍比稀释法分别测定了样品的溶血活性、抑菌谱，得出了该样品的最低 杀菌浓度和最低抑菌浓度。研究结果表明，分离得到的马氏珠母贝抗菌肽具有广谱抗菌 活性，对藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)的最低抑菌浓度为0．63mg／mL，最低杀菌浓度为0．75mg／mL： 对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aure