抗虫耐草甘膦融合基因表达载体的构建及在转基因烟草中的分析-农业昆虫与害虫防治专业毕业论文.docxVIP

摘要随着植物基因工程的发展，将多个基因转化植株已成为研究的热点之一，利用连 摘要 随着植物基因工程的发展，将多个基因转化植株已成为研究的热点之一，利用连 接肽进行多个基因融合的策略已引起广泛关注。以2A和LP4为连接肽表达的融合基 因在植物中表达时会发生剪切，将两个基因分开。本论文利用连接多肽2A和LP4／2A 分别与抗虫新基因Bt crylAh和编码EPSP合酶的耐草甘膦基因鹏连接起来构建融合 基因表达载体，既可以达到两个基因的融合，又可以通过剪切形成两个蛋白分别行使 功能。 为了比较连接肽2A和LP4／2A的剪切效率，以及不同基因与连接肽连接位置差异 对基因表达的影响，利用重叠PCR及DNA克隆技术共构建了四个融合基因表达载体： pHAG、pHLAG、pGAH、pGLAH。其中pHAG、pHLAG为crylAh基因在前，施基因在后， 前者以2A为连接肽，后者以LP4／2A为连接肽；pGAH、pGL^H为施基因在前，crylAh 基因在后，前者以2A为连接肽，后者以LP4／2A为连接肽．同时构建了两个单基因载 体pSAh、pSmG。作为对照，比较两基因在不同载体中表达量的异同。 利用农杆菌介导法将构建的植物表达载体转入烟草中，得到再生植株529株，经 GUS组织化学分析，其中有261株再生苗为阳性植株，转化率达到49．3％；对GUS检 测结果阳性的植株，分别利用crylAh，施基因内部引物进行PCR扩增，结果表明目 的基因整合到了烟草的基因组中；RT—PcR结果显示转化的外源融合基因在烟草体内 正确转录，融合基因在转录水平上没有发生剪切；Western Blot结果表明crylAh基 因和施基因在植物体内J下确翻译并且完全剪切；ELISA检测转融合基因表达载体 pGLAH烟草中fflGz蛋白的表达量达到转基因烟草叶片可溶性总蛋白的0．33％，明显高 于对照载体及其它融合基因表达载体，而crylAh在各载体中的表达量都在0．2％以上。 将获得的转基因烟草进行了生物活性测定。抗虫性生测为棉铃虫初孵幼虫，结果 表明转融合基因表达载体植株对棉铃虫的校正死亡率均在90％以上；草甘膦耐受性检 测选用浓度为3‰的草甘膦喷洒To代植株叶片，融合基因表达载体pGLAH表现出良好 的抗性，存活率为100％，还对T．代转基因烟草种子在含有草甘膦培养基上的出芽及 生长情况进行了统计，结果表明转融合基因表达载体的转基因植株具有草甘膦耐受 性，其中转融合基因表达载体pGLAH的烟草种子可以在5mM的草甘膦培养基中正常发 芽、生长，高耐植株占检测植株的87．5％。相对于单价基因表达载体，融合基因表达 载体表现出较高的抗虫性和耐草甘膦性。 以上转基因烟草的分子生物学分析以及生物活性分析均证明：以LP4／2A为连接 肽时，两个基因的表达水平高于单独表达的基因，同时在连接肽前面基因的表达要高 于其在连接肽后面基因的表达。 关键词： crylAh；mG2；融合基因表达载体；转基因植株；烟草 The The Construction of the Co-ordinated Expression Vectors with Insect ResistanceJGiyphosate Tolerance and Analysis in Transgenie Tobacco Plants Author．Yaaping Li Supervisor：．Prof．Guoxun Li and Dr．Zhihong Lang Major．Agriculture Entomology and Pest Control Abs仃act Witll the development ofplant genetic engineering,the research for introducing multiple heterologons proteins into plants becomes one ofthe hot spots and the polyprotein strategy for multiple genes transformation is paid more attention to．11poljtprotein,encoded by a single open reading flame(oRf)with 2A or LP4 as 1inkcr,was dissociated into two or multiple proteins when it was expressed in plants．In this study,the novel Bt crylAh gene was connected with the m岛gene encoding E