枯草芽孢杆菌α淀粉酶基因的克隆、表达和分析-微生物学专业毕业论文.docxVIP

致 致 谢 本文是在我的导师马向东副教授悉心指导下完成的。除了在选题、 查阅文献、实验技术、论文写作等多方面的具体指导外，导师认真严谨、 一丝不苟、勇于创新的治学精神使我受益匪浅。 在实验过程中，贾新成教授、吴坤院长、陈红歌副教授、吴云汉教 授就实验中出现的问题提出过不少建议。李洪孟书记、李为副书记、高 向阳副院长和王玉兰副院长也给予了很多的关心与帮助。王明道老师、 张世敏老师、宋安东老师、赵柏叶老师、赵玉萍老师、胡渝老师为实验 的顺利进行提供了诸多便利。 从实验的开始到结束，和同学们的互相合作，使试验工作顺利进 行，同时也和他们建立了深厚的友谊。师兄张勇法、师姐柯涛在实验初 始阶段给予很大帮助。在和任艳丽、张建云、许君、刘娜、王艳婕、杨 历军、高德富、谷立坤同学三年的共同学习和生活中，得到他们很多的 帮助。在此谨向关心和帮助我的老师和同学表示衷心的感谢。 最后，谨将我的论文献给我的父母、亲人和我的朋友王海胜。在我 三年求学生涯中，是他们无私的鼓励和支持使我顺利完成了学业，是他 们的爱支持着我克服了许多困难。 蒋培霞 2004年6月 1文献综述{．1基因壳隆技术方法及进展 1文献综述 {．1基因壳隆技术方法及进展 1．1．1基因克隆技术概述 基因(gene)是遗传物质的摄基本单位，也是所有生命活动的基础。不论要 揭示菜个基因的功能，还是要改变巢个基因的功能，都必须首先将所要研究的 基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。 一般来说，基因党隆技术包括把来自不同生物的基因月有皇主复制裁力 《茹 每 ㈣ 的载体DNA在体钋人工连接，构建 鬟粼窝l鐾；瞪 措韩瀚辟糍成凝的重组DNA，然蜃送入受体生 面夸出：摔 物中去表达，从愿产生遗传魏缀窝 状态的转移帮曩掰缝合(懿图l。1 骈示)。因姥基因克隆技术又称为分 臻囊瓣纛 l辩鳓霉轳 子竟隆、基因熊无性繁殖、基因操 蠢 撵、耋缝DNA技术熬及基因工程 粼撇赫搿姻舔等。 它的最大特点，就燕戳耋组 DNA的技术，开辟了在短时闷肉改 ；黜簟嫩 造生钫遗传性状的新天遣。它蝼补 篝穗鬻耩蒜瓣赣尊擞鞭粼I蒜酸蜷 了生物种满阊不可途越的漓沟，克 整，．{蕊鞠竞囊蛙鼹缣蠢聪 旅了常规育种的盲目性，使人类有 可能按照需要定简培育生物新晶种，新类罄乃至宅日造自然界从未有邋的新生 物。基因工程正以新的势头快速发展，成为当今生物科学研究颁域中最有生 命力，最弓i入注目的前沿科学之一。 基因克隆技术在短短不过20年的时间内已经取得了许多激动人心的成 果。人类基因组计划(HGP)的迅速进展及几种模式生物基因组测序的相继完成 为人类提供了大量的基因组信息，这已成为人类探索生命奥秘的入手点。同 时也为后基因组时代提供了更富有挑战性的任务。基因组学时代的主要任务 时也为后基因组时代提供了更富有挑战性的任务。基因组学时代的主要任务 是图谱制作和序列测定，IIII学IIII是IIIIIIIIII，这也是 功能基因组学的主要研究目标。但如何利用这些研究成果为人类服务，基因 则是一个重要的资源。克隆化基因不仅可以用来兴旺生命科学工业(如制药业 等)，改良农作物、农畜品种等，还可以对遗传性疾病进行基因治疗，探索疾 病的分子机制和生物发育调控规律“3。由于基因组计划要耗费大量人力、物 力、财力，所以并非每一种生物都可以拿来测序，而且模式生物的基因有时 并不能直接用于其它生物，因而克隆其它生物中对人类有益的基因也变得日 益重要。在这样一个大环境下，克隆基因的技术也随着分子生物学发展的步 伐而日臻完善和多样化。 1．1．2基因克隆方法 1．1．2．1据已知序列克隆基因 这是基因克隆方法中最简便的一种，即从文献中查取别人报道过的基因 序列，并将它直接作为自己克隆的依据。首先根据整个基因序列设计特异的 引物，通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT—PCR克隆eDNA。刘 莉等。’进行部分序列分析表明芝田硫化叶菌Bl。新型Q一淀粉酶基因同硫矿硫 化叶菌珊I新型a一淀粉酶基因的核苷酸序列有很高的同源性，参照硫矿硫 化叶菌KMI的相应核苷酸序列，合成引物，以芝田硫化叶菌B。。染色体DNA为 模板进行PCR扩增，得到了新型n一淀粉酶基因。 根据蛋白质的氨基酸序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基 因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或eDNA序列。如果蛋白质 序列是自己测定的，那么需要设计至少1对简并引物，从DNA文库中克隆该 基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 此外，还可以序列己知的探针来克隆基因，这也是一种较直接的方法。首先 将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA 杂交，最后将所识别的片段从胶中切下来，回收克隆到特定的载体(质粒、 噬