马传染性贫血病毒LTR嵌合克隆生物学特性的研究-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

摘要摘要 摘要 摘要 马传染性贫血病毒(Equineinfectious anemia virus，EIAV)是反转录病毒科慢病毒属成员 之一，在基因组结构和抗原性上与人艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)十分 相似，可咀引起马属动物的一种急性烈性传染病，以贫血、持续感染、反复发热为特征，终 生持续感染，是马属动物最重要的传染病之一。 二十世纪七十年代沈荣显等通过体外细胞传代致弱路线研制成功了马传贫驴白细胞弱 毒疫苗，并以此成功控制了马传贫在中国的流行，是迄今为jr_『廿=界上唯一大规模应用的慢病 毒疫苗。该疫苗具有良好的安全性和有效性，成为研究包括艾滋病毒在内的慢病毒疫苗的良 好模型。马传贫弱毒疫苗致弱路线是：将一株来源于马体的EIAV超强毒力的辽毒株(LN) 经过驴体连续传代100余代使病毒毒力增强后获得了驴强毒株(Dv)(对马和驴均100％致 死)，然后将DV株连续通过驴白细胞进行体外培养驯化，使其病毒毒力完全丧失，而保持了 良好的免疫原性，最终培育成功EIAV驴白细胞弱毒疫苗(DLA)(沈荣显等，1979)，DLA 进一步通过驴胎皮肤细胞培养驯化，义获得了皮肤细胞弱毒疫苗株(FD)。 为了揭示我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱及免疫保护的分子机制，为人免疫缺陷病毒及其 它慢病毒的免疫预防提供借鉴，利用我国拥有的马传染性贫血病毒疫苗培育系统(由强毒到 弱毒的不同代次病毒)，对EIAV弱毒疫苗致弱过程中EIAV非编码区LTR进行了序列分析， 将病毒致弱的基因变异位点锁定在有限范围之内。本试验基丁．代次毒分析结果，选取LTR变 异率较高的u3区，以驴胎皮肤弱毒疫苗感染性分子克隆株pLGFD3．8和驴强毒株感染性分 子克隆株为父本操作系统进行基因替换，构建EIAV非编码区强弱毒嵌合的全基因分子克隆， 将阳性重组质粒命名为pLGFD9—12。将该嵌合克隆体外转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白 细胞(DL)传代，通过逆转录酶活性试验、前病毒DNA PCR扩增、R1：PCR方法及实时定 量RT-PCR等试验验证其转染结果。结果显示，LTR嵌合克隆衍生病毒感染FDD和DL细胞 均出现明显的细胞病变，电镜下可见大量典型的EIAV颗粒，将其病毒命名为vLGFD9—12： 细胞培养上清可检测到RT酶活性；前病毒DNAPCR扩增和RT-PCR均为阳性。在细胞水平 上对该嵌合克隆衍生毒及其亲本感染性分子克隆毒株复制能力进行了检测，发现此嵌合克隆 衍生病毒与其父本克隆衍生病毒具有相似的复制水平，此嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复 制水平略高于FDD细胞，保持了亲本皮肤弱毒疫苗感染分子克隆的复制特点和细胞嗜性。 同时也说明E-box基序和GATA基序的改变并没有引起LTR对病毒复制和细胞嗜性的影响。 将5匹EIAV阴性健康马分为3组，第l组(2#马)作为非接种健康对照组，第2组(15# 和17#马)接种驴胎皮肤弱毒疫苗感染性分子克隆衍生毒pLGFD3．8，第3组(20#和30#马) 接种LTR嵌合克隆衍生毒vLGFD9-12。接种剂量均为每匹马5ml×105TCID”接种途径均为 皮下。接种后，每日观察试验动物体温和临床症状、定期采集试验动物肝素抗凝外周血，分 析其血液学变化、病毒在接种动物外周血中的拷贝数水平及不同时间诱导动物体特异性淋巴 细胞增殖水平、特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤反应，明确LTR与毒力的相关性及该嵌合克 隆毒株与其父本弱毒疫苗株在马体复制和分布的情况。在150天观察期内，各组试验动物均 朱见体温升高，仅15#马在第47天有一次短暂的一过性发热，达39．1℃，但为一过性发热。 东北农业大学农学博士论文m液学分析发现，第二二组和第三组试验动物白细胞与血红蛋白含量总体上看没有发生明显的 东北农业大学农学博士论文 m液学分析发现，第二二组和第三组试验动物白细胞与血红蛋白含量总体上看没有发生明显的 规律性的变化。在动物外周血中均检测到一定的病毒RNA拷贝数，但拷贝数较低，说明LTR 嵌合克隆衍生毒与其父本弱毒疫苗感染性衍生毒一样，在体内复制水平较低。二者在诱导 EIAV特异性淋巴细胞增殖功能和特异性细胞毒性杀伤反应中，亦具有相似的变化趋势哥II效 应。本项研究为进一步确定我国马传贫弱毒疫苗株毒力致弱及免疫保护的分子机制奠定了重 要的分子生物学基础，将为其它人和动物慢病毒的免疫预防的研究提供依据。 关键词：马传染性贫血病毒；长末端重复：感染性分子克隆；衍生病毒 AbstractConstruction Abstract Construction and characterization of a chimeric infectious clone of Chinese equine infectious