海肾荧光素酶报告基因.docxVIP

海肾荧光素酶报告基因 　　双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项　　转载请注明来自丁香园发布日期：XX-03-2613:43文章　　分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网　　关键词：双荧光素酶报告基因载体点击次数：24521．报告基因检测受多种因素影响，因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。　　2．细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。　　3．双荧光素酶报告基因的载体选择：　　a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；　　b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子，而选用中等强度的启动子。　　4．双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整，萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。　　5．最适反应温度：室温。各个组分都需要调整到室温。　　6．双荧光素酶反应体积：20ul-100ul-100ul，底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差　　7．细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年　　8．裂解产物与底物混合：要求混合快速、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。　　9．发光半衰期：　　a)单荧光素酶检测试剂盒，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约12min　　b)双荧光素酶检测试剂盒，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2min　　10．检测结果　　检测前应检测孔板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；　　样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。　　荧光素酶报告基因检测　　?原则　　荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。检测步骤如下：　　1)加裂解缓冲液裂解转染的细胞。　　2)将上述裂解物转移入微孔板或者试管中。　　3)加入含有所有酶反应成分，使化学发光反应开始。　　4)用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。　　?特点　　?敏感度和检测范围：5fg荧光素酶　　?发射光的线性范围：10fg—10ng　　?确切的检测限依检测仪器而定。　　?特异性：本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶　　基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。不适用于对细菌荧光素酶进行检测。　　?器材和试剂　　?器材　　在微孔板或试管中，用自动或手动荧光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。　　?试剂　　1)荧光素酶检测试剂：荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些　　试剂可以启动酶反应。这种荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，-15℃~-25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。避免反复冻融。应避光保存，因为荧光素在光照下会发生氧化。　　2)裂解缓冲液：下面将加以介绍。　　?基本操作步骤　　下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。提取物必须立刻检测，否则必须在-15～-25℃储存大约一个月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。　　1)将荧光素酶报告基因与?-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。　　2)彻底吸去培养皿中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液　　小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。10×PBS缓冲液：NaCl100g，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，用三蒸水定容至1000ml。　　3)加入最小体积的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液盖过细胞，例如60mm的培养皿用360?l裂　　解液，35毫米的培养板用150?l裂解液。用橡皮刮将细胞刮离培养皿。将裂解物转移到微量离心管中。Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液：1%TritonX-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸，15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，1mmol/LDTT　　4)在漩涡混合器上轻轻振荡细胞裂解液，以最大速度4℃离心以去除细胞碎片。将上清转移到另　　一个微量离心管中，置于冰上以备分析。　　5)在开始化学发光反应之前，将100?l的细胞提取物转移到荧光仪或者液闪计数仪所用的检测　　器皿中。加入360?l荧光素酶分析缓冲液。荧光素酶分析缓冲液：25m　　mol/L甘氨酰