马立克氏病病毒meq基因功能的研究-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

韦平，马立克氏病病毒meq基因功能的研究中文摘要 韦平，马立克氏病病毒meq基因功能的研究 中文摘要 马立克氏病病毒(Marek’S Disease Virus，MDV)之众多已得到鉴定的基因中，目前 有3个基因即Jj2-印，、pp38、meq可能与致瘤相关。其中，meq与132一印，两个基 因是MDV．1所特有，已证实132．幻，的拷贝数与毒株的体外致弱程度有关，pp38则 被证实可抑制机体的免疫应答。meq基因由于具有与致瘤基因jun／fos家族类似的分 子结构，因此，我们有理由认为meq基因在MDV致病、致瘤中可能发挥重要的作用。 本研究通过三个方面进行了研究，取得了如下主要实验结果： l MDV不同致病型(pathotypes)毒株meq基因序列的比较研究 应用PCR技术扩增了不同致病型MDVs，即国际通用I型疫苗毒 CVl988／Rispens株和中国特有的疫苗毒814株、特超强毒648A株(w+MDV)以 及6个广西分离到的野毒株共9个毒株的meq基因，进行核苷酸序列的测定并 与标准强毒GA株(vMDV)进行核苷酸和氨基酸序列的比较。结果发现，MDV 不同致病型的meq基因序列相对比较保守，它们相互间核苷酸和氨基酸序列的 同源性均很高；但是，与所有七个致瘤性的MDV毒株相比，二个I型弱毒疫 苗CVl988／Rispens株和814株均出现了两个特征性的突变：即第194位的P 缺失性突变和第71位氨基酸由A变成了s的位点突变；缺失性突变恰恰位于 meq基因中转录激活域内的一个多脯氨酸的重复序列(PPPP)之中。此外，研 究还发现了meq基因的两类有趣的重复结构，其中一类是含1 5个氨基酸残基 (EELcAQLcsTPPPPI)的结构，有2个重复，另一类是含6个氨基酸残基(PPICTP) 的结构，共有4个重复，它们全部分布在MEQ蛋白C一端的转录激活域内。 2 meq基因产物的鉴定及其细胞内表达特征的研究 源于MDV GA株的meq基因被克隆到杆状病毒转移载体质粒pBluBac4 中强有力的多角体蛋白启动子(PPH)之后，经与线性化的Bac．N．BlueDNA共转 扬矧大学媾士学位论文 扬矧大学媾士学位论文 2 染于昆虫细胞系SF9，获得了重组杆状瘸毒。应用重组痘瘸毒表达的MEQ制 备的单抗23846对重组抒状瘸毒感染的SF9细胞及其裂姆物分别进彳于间接免疫 荧光试验、Western Blot粒免疫泼淀试验豹检测。结果发现：本袭达系绞产生 酌MEQ蛋鑫霹被耋缀痘病毒表达款MEQ镶l备豹攀获23846辑识裂；京感染 缅稔中，MEQ蛋白仅局限于缁飚核内，而羹随着惑染螽(Pi)时闯的增笳，其有 从梭质向梭仁和梭膜转移的麓向：Western Blot和免疫沉淀试验均证实熏组秆 状病毒感染细胞裂解物中出现有两条大小约为60 kD的特异带。实验的结果证 明杆状病毒／昆虫细胞系统用于表达外源基因可行有效。 刮用通过轩状病毒载体在昆虫细胞系SF9上高度表达的MEQ蛋白产物免 疫BALB／e小鼠，然爱收获其免疫黪缨照并与黪癯细胞惹SP2／0逶过PEG于体 终融合；获得熬袈交瘥缨骢被克隆著遽过与MDV感染熬鸡题成纤维鲴德 (CEF)傲免疫荧先试验(FA)，进行冀分泌抗MEQ荦充隆抗体(McAb)能 力的筛选。获得4株稳定产警抗MEQ蛋白McAb的杂交瘸缅施，其中3G12E6 单抗通过FA和免疫酶组化技术能够检测到MDV致瘤株感染的CEF及自然 MD肿瘤细胞中表达的meq基因产物，而在非致瘸株CVl988IRispens感染的 CEF和免疫的正常鸡的组织中则未检测到。研究的结果首次发现，MDV致瘤 株GA、RBlB感染的CEF及自然MD肿瘤细胞中均有相豢水平的meq基因产 物数表达。 3通过构建重组反转泶病毒研究meq基因的功能 应用磷酸镪与MDV meq基因重组的反转录痍毒转染裁体质粒RCAS-meq的 DNA，转染子鸡珏成绎维堂骧缒系DFt。经阕接兔疫荧必技枣磷突袭戆，转染矮第3 天帮开始膏少羹DFl绸胞在缁麓按表达MEQ簧自，戳后阳性缩胞增多，至转染磊第 7天阳往细胞最多，之后荧光邸衰减；通过酶联兔疫吸附试验(ELISA)检测，发现缁 胞培养上清中游离病毒在转染后第5天即可检出，直至第7天仍蠛持袋高水平，第9 天开始下降：用细胞培养上清感染DFl细胞单层，于感染后篇2天即可检出MEQ 蛋白阳性细胞，之后阳性细胞逐渐增多，到第扯5天达高峰，之后逐渐衰减；培养上 韦平．马立克氏病病毒meq基因功能的研究清中的游离病毒在感染后第4天即可被检出，第5～7天达最高值。 韦平．马立克氏病病毒meq基因功能的研究 清中的游离病毒在感染后第4天即可被检出，第5～7天达最高值。 利用重组反转录病毒(RCAS-meq)感染鸡胚成纤维细胞(CEF