慢病毒介导RNAi沉默RhoA基因对人卵巢癌裸鼠移植瘤生长的影响及基因治疗研究-妇产科学专业毕业论文.docxVIP

中文摘要 中文摘要 广州医科大学硕士学位论文 广州医科大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 万方数据 万方数据 慢病毒介导 RNAi 沉默 RhoA 基因对人卵巢癌 裸鼠移植瘤生长的影响及基因治疗研究 中文摘要 研究背景 侵袭和迁移是恶性肿瘤转移的重要特征，大约 90%的患者死于肿瘤的复发和 转移。在妇科恶性肿瘤中，卵巢癌死亡率位居首位。因其临床症状隐匿，诊断时 75％的患者已属晚期，虽然超过 80%的患者经一线治疗受益,但 III/IV 期卵巢癌 患者的 5 年生存率徘徊在 25%-30%。因此，深入了解卵巢癌发生发展的分子机 制，并寻求新的治疗方法刻不容缓。目前基因治疗为卵巢癌的治疗提供了新的希 望。近年来兴起的 RNA 干扰技术因具有很强的转录后基因沉默作用，由于其高 效性和特异性在基础研究方面展现出强大的优势，然而如何将其优势发挥到临床 靶向治疗却是一个难题。 RhoA 基因是 Rho 家族成员之一，作为恶性肿瘤侵袭及转移的“开关”基因， 参与多种恶性肿瘤的发生发展。RhoA 基因激活可以导致细胞癌变，且 RhoA 信 号通路在参与调控肿瘤的生长和增殖、侵袭和转移、细胞凋亡及肿瘤新生血管形 成等方面发挥重要作用。因此，以 RhoA 基因为靶点的基因治疗将有望成为卵巢 癌靶向治疗的一个新方向。 本研究组在前期研究中，已利用 RNA 干扰技术成功构建了针对 RhoA 基因 的慢病毒干扰载体并建立了卵巢癌稳定沉默 RhoA 基因细胞株，且体外实验证实 慢病毒介导 RNAi 下调 RhoA 基因表达可抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭及迁移能力。 由于体外实验并不能完全真实的评价对于卵巢癌干预措施的可行性和有效性，而 建立合适的裸鼠移植瘤模型对于模拟卵巢癌的病理状态并评价治疗措施是必须 的，且有着非常重要的作用。故本研究在此基础上，建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型， 首先探讨 RhoA 基因沉默对卵巢癌裸鼠腹腔侵袭转移等恶性生物学行为的影响； 其次采用慢病毒介导 RhoA shRNA 对其卵巢癌裸鼠皮下移植瘤进行抗癌治疗的 研究，以探讨其可行性、有效性及抗肿瘤机制。 1 第一部分 RhoA 基因沉默抑制卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤恶性生物 学行为的研究 目的 构建卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，研究慢病毒介导 RhoA 基因沉默对人 卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生长、侵袭及转移等恶性生物学行为的影响。 方法 1. SPF 级雌性 BALB/C 裸鼠 21 只应用随机数字表法分为三组,利用已建立的稳 定沉默 RhoA 的 HO8910-RhoA-shRNA 细胞，阴性对照组 HO8910-RhoA-NC 细胞，和空白对照组 HO8910 细胞这 3 组细胞分别建立裸鼠卵巢癌腹腔移植 瘤模型。 2. 每 2 天测量腹围，4 周后解剖裸鼠。大体观察：测定腹水量；统计肿瘤播散 器官数及瘤结节数；称量瘤体重量，并计算抑瘤率。 3. 镜下观察：应用 HE 染色分析移植瘤病理形态学特点。 4. 实时荧光定量 PCR 和 Western blot 检测移植瘤 RhoA mRNA 和蛋白表达情况。 5. 脱氧核苷酸末端转移酶介导的核苷酸缺口末端标记（TUNEL）技术检测移植 瘤凋亡指数（apoptotic index，AI）。 结果 1. HO8910-RhoA-NC 组和 HO8910 组的裸鼠成瘤率均为 100%，而稳定沉默 RhoA 基因的 HO8910-RhoA-shRNA 组裸鼠成瘤率仅为 71.4%,但差异无统计 学意义(P=0.231)。 2. 与阴性对照 HO8910-RhoA-NC 组和空白对照 HO8910 组比较，RhoA 基因稳 定沉默 HO8910-RhoA-shRNA 组裸鼠腹围增长明显滞后（P0.05）；腹水量明 显减少（P=0.01），肿瘤播散器官数、瘤结节数及瘤体重量均明显减少 （P0.001），抑瘤率达 70.62%； 3. 实时荧光定量 PCR 及 Western Blot 结果显示，与阴性对照 HO8910-RhoA-NC 组和空白对照 HO8910 组比较， HO8910-RhoA-shRNA 组移植瘤 RhoA 基因 mRNA 和蛋白表达水平均显著下降（P0.001）； 4. TUNEL 结果提示，与阴性对照 HO8910-RhoA-NC 组和空白对照 HO8910 组 2 比较， HO8910-RhoA-shRNA 组移植瘤 AI 明显升高（P0.001）。 结论 卵巢癌细胞 HO8910 在腹腔内的生长、侵袭及转移均受到 RhoA 的影响，慢 病毒介导 RhoA 基因稳定沉默时，裸鼠腹腔移植瘤的重量、数量及播散转移均相 应减少，一定程度上延缓了卵巢癌的恶性生物学行为。 第二部分 靶向 RhoA 基因的 shRNA 对卵巢癌裸鼠皮下