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SDS PAGE AND WESTERN BLOTTING Western Blot Western blots allow investigators to determine the molecular weight of a protein and to measure relative amounts of the protein present in different samples. 聚丙烯酰氨凝胶电泳 SDS Western Blot 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis ，简称PAGE ） 作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有 两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native ）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）； 非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能 够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白 质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。 SDS(十二烷基硫酸钠) 仅根据蛋白质亚基分 子量的不同就可以分开蛋白质。 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它 能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破 坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙 醇 ，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫 键断裂。 在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚 成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电 荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构 差异。 考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光 吸收在465nm ；当它与蛋白质结合后变为青色， 蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收 。其光吸收值与蛋白质含量成正比。 G-250 由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用 来作为蛋白质含量的测定。R-250与蛋白质反应 虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可 以用来对电泳条带染色。 Prepare to transfer proteins to a nitrocellulose membrane (硝酸纤维膜) •  Trim gel Mini Trans-Blot Transfer Cell Preparing the Blotting 1. Place the cassette with gray side down on clean surface Sandwich 2. Place one pre-wetted fiber pad on the gray side of the cassette