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细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告 　　实验三细菌的简单染色和革兰氏染色　　一、目的与要求　　1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点　　3、识别细菌革兰氏染色结果　　二、实验原理：　　细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。　　为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。　　用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。　　简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。　　革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G?)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。　　三、实验器材　　1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichiacoli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillussubtilis)斜面菌种；　　2、仪器显微镜；　　3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。　　4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，%番红染色液；细菌的简单染色步骤：　　细菌的革兰氏染色步骤：涂片,干燥,固定,结晶紫染　　色,水　　洗,　　碘液媒染,水洗,乙醇脱色,水洗,番红复染,水洗,干燥,镜检.　　五、实验关键步骤和注意点：　　1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。涂片厚度适当。3、固定温度适当。4、革兰氏染色成败的关键是脱色时间，脱色程度适当。5、染色过程中勿使染色液干涸。　　六实验报告　　1.画出你所观察到的形态并标出革兰氏染色结果。　　2.思考题：　　涂片后为什么要进行固定？固定时应注意什么？革兰氏染色步骤是什么？其中关键步骤是什么？为什么必须用培养24h的菌体进行革兰氏染色？　　实验二细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察　　1.目的要求　　学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。　　掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。　　了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。　　2.基本原理　　简单染色法　　用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。　　常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。　　革兰氏染色法　　革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大