慢病毒介导的人碱性纤维生长因子基因的构建及在鼠骨髓间充质干细胞中表达的实验研究-外科学(普外)专业毕业论文.docxVIP

慢病毒介导的人碱性纤维生长因子基因的构建及在大鼠骨髓间充 慢病毒介导的人碱性纤维生长因子基因的构建及在大鼠骨髓间充 质干细胞中表达的实验研究 摘 要 目的：探讨构建携带人碱性成纤维生长因子(bFGF)的重组慢病毒载体方法并观察碱 性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后bFGF目的基因的表达情况。 方法：采用R卜PCR扩增的方法获取人源性的bFGF与FGF4基因，将目的基因与 载体pGC．FU连接【含绿色荧光蛋I兰t(GFP)]。产生pGC FU-FGF4一bFGF慢病毒载体。PCR 筛选阳性克隆，测序鉴定。通过lipofectamine2000的介导把pGC FU．FGF4．bFGF载体， pHelper 1．0载体和pHelper 2．0载体三质粒共转染至包装细胞293T．应用Real time-PCR 法鉴定和测定滴度。而后转染大鼠骨髓间充质干细胞并检测其表达。MTT法检测到间 充质干细胞经过基因修饰以后和未经过基因修饰的干细胞生长情况 结果： 1．流式细胞仪显示体外分离培养的第3代大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原表达： CDl lb／c阳性细胞表达率为14．2％±0．7％，CD34阳性细胞表达率为1．3％±0．5％，CD44 阳性细胞表达率97．8％±0．9％，CD90阳性细胞表达率96．9％±1．5％。 2．PCR鉴定证实重组慢病毒有人FGF4信号肽一人BFGF，病毒滴度为2．OOE+9 TO／ml。 3．转染大鼠骨髓间充质干细胞后，行RT-PCR检测到BFGF基因转入干细胞内，其 大小约500bp。 4．在荧光显微镜下，观察到转染的干细胞内GFP的表达；通过Western Blot检测 转染的细胞可以观察到36～55KDr之间有明显表达，与FGF4一BFGF—GFP融合蛋白 (’21+28KDr=’49KDr)基本吻合。(备注：构建的pGC—FU—FGF4一BFGF基因插入片断大 小549bp)综上：基本判断FGF4-BFGF表达正常。ELISA检测结果表明转染bFGF的细胞 培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度显著高于空白对照。 5．MTT法检测到间充质干细胞经过基因修饰以后和未经过基因修饰的干细胞生长情 况对比，基因修饰后的目的细胞明显优于未经修饰的干细胞。 4 结论：成功构建的携带人成碱纤维生长因子的慢病毒载体能在293T细胞扩增获得 结论：成功构建的携带人成碱纤维生长因子的慢病毒载体能在293T细胞扩增获得 足够高的病毒滴度，并转染入大鼠骨髓间充质干细胞，经检测可以有效的表达。可以为 下一步基因治疗大鼠下肢缺血提供很好的基础。 关键词：大鼠骨髓间充质干细胞成碱性纤维细胞因子基因转染 慢病毒载体 Constrution andand exl3resslonpression of humanhuman bFGF moleculesDlecul, mediated by lentivirus vector in rat bone marrow stem cells Abstract Obiective To construct the recombinant lentirvirus vector carrying human basic fibroblast growth factor(bFGF)and to observe the expression of adenovirus transfected basic fibroblast growth factor in rat mesenchymM stem cells(MSCs)． Methods huamn bFGF and FGF4 were obtained by usmg RT·PCR amplification，and then cloned into the pGC·FU vector，which contained green fluorescent protein(GFP)．The resulting lentiviral vector containing FGF4 and bFGF was named pGC FU—FGF4-bFGF．After identificationb by PCR and sequencing，it Was transfected into 293T cells by lipofectamine 2000 mediation，together with lentivirus—packaging plasmid pHelper 1．0 and pHelper 2．0．The newly constructed recombinant lentivirus and titra