限制性内切酶原理讲解.ppt

限制性核酸内切酶;;; 限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源，从而保护自身。; 多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的 和 ，以及来源于流感嗜血杆菌（ ）的 和 。这些酶可在特定位点切开，产生可体外连接的基因片段。;;;;什么是回文序列？;II型限制酶; 型限制酶切割后形成粘性末端或平末端分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中应用最多。;;;;有些限制酶识别的序列不是回文序列。 Ⅰ 的识别切割位点分别是 和 Ⅰ 的识别切割位??分别为和;)? 的纯度 )? 的甲基化程度 )? 酶切消化反应的温度 )? 的分子结构 )? 限制性核酸内切酶的缓冲液 ) 活性（星活性）; 限制酶消化底物的反应效率，很大程度上取决于所使用的的纯度。制剂中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、、以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制酶的活性。;的甲基化程度;酶切消化反应的温度;的分子结构;核酸内切限制酶的缓冲液;活性（星活性）; 消化样品后，需要钝化内切酶的活性，终止反应。 方法： ）℃温浴分钟，使酶失活。 ）加入除去酶分子的镁离子，是使酶失活。 ）加或者尿素使酶解聚沉淀。 ）用等体积的酚抽提酶解产物，提取。;; 基因工程中常用的工具酶有限制酶、聚合酶、连接酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端转移酶、甲基化酶。; 将目的基因导入受体细胞前，需要用相同的限制酶将目的基因和载体切成相同的粘性末端，再通过碱基互补配对的方式，在连接酶的作用下，目的基因和载体完成连接。最后将连接好的重组载体导入细胞。;NNNNNNNNNNNA A GC TTNN ? ? ? NNNG GA T CCNNNNNNNNNNNNNNNNNN ;为什么通常要用两种限制酶？;;可不可以用一种酶切割目的基因和载体？;NNNNNNNNNNNA A GC TTNN ? ? ? NNNG GA T CCNNNNNNNNNNNNNNNNNN ; 基因工程中，很多情况下，基因组中靠近目的基因两侧的碱基并没有合适的酶切位点。怎么办？;; 原核生物的甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 不被相应的限制酶所切割。; 甲基化酶在 序列中的腺嘌呤上引入甲基。一些限制酶（如Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ等）的识别位点中含 序列。 有些限制酶对甲基化的 敏感，不能切割相应的序列，如 Ⅰ。有些限制酶对甲基化的不敏感，如 Ⅰ、Ⅰ等。;谢谢观看