枯草芽孢杆菌XM16菌株抗菌蛋白的提取纯化及其作用机理的研究-植物病理学专业毕业论文.docxVIP

枯草芽孢杆菌XMl6菌株抗菌蛋白的提取纯 枯草芽孢杆菌XMl6菌株抗菌蛋白的提取纯 化及其作用机理的研究 摘要 枯草芽孢杆菌XMl6菌株是从苹果树上分离获得的一个对苹果霉心病病原菌具 有特效抑制作用的拮抗菌株，本文对该菌株产生的抗菌蛋白的发酵条件、提取纯化 进行了研究，明确了抗菌蛋白的存在及其抑菌范围，并对该抗菌蛋白的作用方式和 作用机理进行了研究。 发酵条件研究表明，XMl6菌株在以BYP为原料发酵培养时，30℃、200rpm 摇床振荡培养48h，可获得最高活性发酵产物。发酵液经8000rpm离心10min，获 得发酵上清液，向上清液中加入(Ntt4)2S04至50％饱和度，4C静止5h以上，4。C下 10 000rpm离心10min，收集沉淀，将沉淀溶于pH 6．5的磷酸缓冲液中，可获得最 大量的抗菌蛋白，上清液完全丧失抑菌活性。将制得的具有抑菌活性的粗蛋白进行 Sephacryl S-100凝胶层析，通过核酸蛋白检测仪检测到了2个具有强抑菌活性的蛋 白吸收峰，SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳标明蛋白未纯化，应进一步分离才能得到单一 的蛋白组分。热稳定性测试表明，该抗菌蛋白耐高温，121℃高温、高压处理25min 仍具有较强抑菌活性。 从拮抗菌株内提取的抗菌蛋白对病原菌的抑菌表现与活体菌株完全相同，而且 抑菌谱也十分相似，这说明XMl6菌株在培养过程中能产生抗菌物质，从拮抗菌株 内提取的抗菌蛋白至少是该菌株所产生的抑菌物质的一种。抑菌谱试验表明，抗菌 蛋白对供试辣椒炭疽病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、苹果腐烂病菌、苹果炭 疽病菌等多种植物病原菌具有明显的抑制作用。 对抗菌蛋白的作用方式研究表明，抗菌蛋白对苹果炭疽病菌分生孢子形成没有 影响，对西瓜枯萎病菌分生孢子形成有一定影响；对两种供试病原菌的菌丝生长具 有明显的抑制作用，并能极大抑制该种病原菌分生孢子的萌发，即使分生孢予萌发， 芽管也不同程度的畸形。通过显微镜观察发现，抗菌蛋白处理后能使菌丝严重畸形， 顶端及中部膨大，原生质泄漏，这为深入研究其作用机理提供了重要依据。 以番茄叶霉病菌为靶标菌，进行了抗菌蛋白作用机理的研究。结果表明：①抗 以番茄叶霉病菌为靶标菌，进行了抗菌蛋白作用机理的研究。结果表明：①抗 菌蛋白的最小抑菌浓度为lmg／mL，最小杀菌浓度为2mg／mL。经抗菌蛋白处理的番 茄叶霉病菌菌丝顶端均产生了一个很大的球状泡，整条菌丝严重畸形，细胞内含物 发生外渗，在260rim处出现明显吸收峰，说明抗菌蛋白的作用位点在细胞膜上。② 抗菌蛋白对菌体可溶性蛋白的合成没有明显影响，也不具备分解细胞壁中几丁质的 能力。③抗菌蛋白接种番茄叶片，不但没有危害产生，而且还可促进番茄幼苗根的 生长、增加叶绿索含量、提高植物体内的PAL、CAT和PPO三种防御酶的活性。 关键词：枯草芽孢杆菌；Ⅺ垤16菌株：抗菌蛋白：作用机理 Extraction Extraction and Purification of Antifungal Protein Produced by Strain XMl 6 of Bacillus subtilis and Study on Antifungal Mechanism of the Protein Abstract XMl6 Was a strain of Bacillus subtilis，which was isolated from apple tree and showed inhibiting effect to pathogens of apple mould core．Former studies showed that the bacterial strain produced a kind of protein and the protein exhibited the activity of anti-fungi．This paper reported studies on ferment condition，extraction and purification of antifungal protein，and studies restrain spectrum and presence of the antifungal protein，髂well as active mode and active mechanism of antifungal protein on anti-fungi． Strain XMl6 was cultured in different conditions and studied the antagonistic activity of the solid ferment product