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微生物的检验与检测 ** 生命科学学院 09级生物工程班 【摘要】水的微生物学检验，特别是肠道细菌的检验，对保证饮用水安全和控制传染病有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。 水的微生物检查通常包括两个项目：细菌总数和大肠菌群测定。 所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-formingunit，CFU)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。 所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。 【关键词】细菌 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是卫生领域用语。大肠菌群包括了大肠艾希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 　　大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 　　大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（琼脂为1.5%）；乳糖蛋白胨培养液(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏?3，乳糖 5，氯化钠 5，溴甲酚紫 0.016，pH 7.3伊红美蓝培养基(g/L)：蛋白胨 10，乳糖 10，磷酸氢二钾 2，2%伊红水溶液 20ml，0.5 %美蓝水溶液 13ml ，琼脂 20，pH 7.2 1.1.2 实验用品：水样采集器（灭菌处理），Eppendorf离心管，Tips，微量加样枪，无菌水，250ml三角瓶（灭菌处理），灭菌培养皿 1.1.3 标准菌株：标准大肠埃希氏菌与沙门氏杆菌斜面培养物，经实验十一鉴定为大肠菌群的斜面培养物 1.1.4 抗血清：兔抗沙门氏菌、大肠埃希氏菌菌体的抗血清(委托公司制备) 1.2 水样采集 1.2.1 采月湖水的采集：用ETC-1A采水器采集0.5-1米 1.2.2 采集疑似大肠菌群较多的水源，方法同上。(南京外国语学校仙林分校北门口河水) 1.3 样品处理 1.3.1 池水的稀释：在灭菌离心管中取100μL池水加900 μL无菌水，混匀，制备10-1的稀释液。原液和10-1的稀释液用于平板计数。 1.3.2 根据南京外国语学校仙林分校北门口河水水样的污染程度将水样稀释成10-1、10-2稀释度。 1.3.3 抗体的制备：选择健康的兔子作为抗血清制备动物。注射灭活的抗原菌液（浓度约为109/mL，第1次耳缘静脉注射0.2 mL，以后每隔2d注射1次，抗原注射量依次为0.4 、0.6、1、2 和2mL等。取血，分离血清，测其凝集效价。若效价符合要求后，取兔血，待血凝后，离心分离出血清，装入灭菌的血清瓶中并加入0. 01%硫柳汞（防腐剂），-20度保存，备用。 1.4 样品的平板操作 1.4.1 池水样(每组5块平板) 取原液和10-1稀释度的水样各1ml放入培养皿内，倾注15mL融化后冷却的牛肉膏蛋白胨培养基，立即在桌面作平面旋摇。注意样品与培养基混合时，可将皿底在平面上先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转，使其充分混匀。旋转时小心，不要使混合物溅到皿边上方。每个稀释度做2个平皿，然后置于37℃ 另取一无菌培养皿，倾注15mL牛肉膏蛋白胨培养基作为整个检测试验的空白对照。 1.5 大肠菌群的检测（多管发酵法） 1.5.1 初发酵检测（乳糖蛋白胨液体培养基 ） 1.5.2 平板分离 将24h培养产酸产气的发酵管内的培养物分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上，37℃培养18-24h，将符合下列特征的菌落的一小部分进行涂片作革兰氏染色并镜检。 ①深紫黑色、有金属光泽； ②紫黑色、不带或略带金属光泽； ③淡紫红色，中心颜色较深。 伊红和美蓝可抑制G+生长；不发酵乳糖的细菌