酶的分离纯化及活性测定.pdf

第五节第五节 酶的分离、纯化及活性测定 1 一、酶的分离、纯化 • 胞外酶胞外酶:一类类由由细细胞胞内产内产生然后分生然后分泌到到细细胞外胞外进进行作行作用 的酶，这类酶大多都是水解酶类。 • 胞内酶 :另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用 的的，这类这类酶酶数数量量较较多多。 2 一般原则：般原则： 防止强酸、强碱,要求加入的化学试剂不使 酶变性； 在低温下操作，全部操作在低温0～4℃； 在分离提纯过程中在分离提纯过程中 ，避免剧烈搅拌避免剧烈搅拌 ； 在提纯溶剂中加一些保护剂在提纯溶剂中加一些保护剂 ，如少量如少量EDTAEDTA、 少量β-巯基乙醇； 在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激 烈烈”的的手段。 3 酶的分离提纯三个基本环节 ： 第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液； 第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分 离出来 ； 第三制剂，即将酶制成各种剂型。 在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事： 第第一，测测定酶活力定酶活力(IU/ml)(IU/ml) ；； 第二，测定蛋白质含量(mg/ml)； 第三，测量体积(ml)。 4 基本操作程序基本操作程序 微生物、动物、 选选材材 植物植物 加入提取液抽提 胞 内酶先破碎 抽提 先净化处理 再沉淀法分离 离子交离子交换层换层析析， 凝胶过滤，液 分离 纯化 相色相色谱谱，亲亲和和 色谱和超滤等 5 （（一））酶的抽提酶的抽提 11、、破碎细胞破碎细胞 对于细胞外酶可用水对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过缓冲液浸泡过 滤后，可得粗抽提液。 对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞 较易破碎较易破碎，，通常用匀浆器通常用匀浆器、捣碎机捣碎机，，制成制成 匀浆离心后可得酶抽提液。 细菌细胞壁较胞壁较厚，需用超声声波、溶溶 菌酶等酶等抽提提。 6 2、酶的抽提酶的抽提 一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽 提出来提出来。抽提条件抽提条件： ⑴⑴抽提溶的抽提溶的pHpH选择应该在酶的选择应该在酶的pHpH稳定稳定 范围之内，，并并且最好远离离等电点。 ⑵低温下抽提低温下抽提