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五子衍宗方主要药效学成分 药代动力学方法研究 项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心 项目完成人： 马 辰 五子衍宗方为中药经典古方，源自唐代《悬解录》。其功用主治为补肾益精，用于治疗肾虚腰痛，尿后余沥，以及不孕不育症等。中国药典以成方制剂五子衍宗丸形式收载，其处方组成为：菟丝子400g、枸杞子400g、覆盆子200g、车前子100g和五味子50g。在五子衍宗方中菟丝子和枸杞子为方中的君药。目前中国药典对五子衍宗丸仅有性状和定性鉴别，未有含量测定。 菟丝子为旋花科植物菟丝子Cuscuta chinensis Lam. 的干燥成熟种子，为常用中药，具有滋补肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻等作用，其中黄酮类化合物为主要成分。目前从菟丝子中提取并鉴定出结构的黄酮类成分有金丝桃苷、槲皮素、紫云英苷、山奈酚等。目前中国药典2000版一部中，未对菟丝子进行含量测定。 菟丝子中含有的主要化学成分以槲皮素及其苷为主，其中金丝桃苷为含量较高的槲皮素苷，因此对菟丝子和五子衍宗方进行含量测定时，以金丝桃苷为指标成分，其理化性质及结构如下： 物理性状：淡黄色针状结晶（乙醇），熔点227～230℃（237～239℃分解），比旋度[α]20D=-83。（C=0.2吡啶），易溶于甲醇、乙醇、丙酮及吡啶。 金丝桃苷化学结构： 一、五子衍宗方及菟丝子中金丝桃苷的含量测定 1 实验材料及仪器设备 1.1 药品及试剂 金丝桃苷对照品：本所植化室提供，纯度达95%以上 五子衍宗方药材（菟丝子、枸杞子车前子、覆盆子、五味子）：北京同仁堂药店 磷酸（分析纯）； 无水乙醇（分析纯）；乙腈（色谱纯）；Fisher甲醇：（色谱纯）；双蒸水 1.2仪器设备 Waters 2690高效液相色谱仪及996-二极管阵列检测器，Millennium32色谱软件，有机相微孔滤膜（0.45μm）针头滤器，BUCHI 461电热恒温水浴箱 2 色谱条件选择 菟丝子及五子衍宗方中黄酮类成分较多，其中菟丝子中以槲皮素及其苷为主，五子衍宗方中除菟丝子含有黄酮类成分外，车钱子中也含有车钱苷等黄酮类成分。参考文献对菟丝子及五子衍宗中的金丝桃苷测定的色谱条件进行了优选。 2.1检测波长的选择 从金丝桃苷的紫外光谱Fig. 1可见，其在254nm和355nm均有较大的吸收，文献中多以355nm作为对金丝桃苷的检测波长，主要考虑其它干扰成分在此吸收较低。因此本论文对菟丝子中含量测定时，首先考虑了355nm作为检测波长，而对五子衍宗方进行含量测定时，其他成分对主峰有干扰，而主要干扰成分在254nm却有较低的吸收，并与主峰能实现基线分离。因此对五子衍宗方中的金丝桃苷进行含量测定时选用了254nm。 图1 金丝桃苷甲醇溶液的紫外光谱 2.2流动相的选择 首先以流动相甲醇－0.5%磷酸（50：50，用三乙胺调pH至3.0），实验中发现柱效下降很快，分析认为使用三乙胺调pH，对色谱柱的损害太大。考虑到常规C18色谱柱的酸性适用范围，在上述流动相基础上分别考察了0.5%醋酸、0.05%三氟乙酸以及0.1%磷酸，从保留时间、分离度和拖尾因子角度进行评价，优选了最佳的流动相组成。最终确定甲醇：乙腈：0.1%磷酸 ( 40:5:55)作为金丝桃苷流动相条件。 2.3色谱条件 色谱柱：Alltech C18柱（5μm，250mm×4.6mm i.d） 流动相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55） 流速：0.8mL/min，柱温：25℃， 检测波长：355nm（菟丝子含量）；254nm（五子衍宗方含量） 3 实验溶液制备 3.1对照品溶液的配制 精密称取金丝桃苷标准品10mg置于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，备用。精确量取上述金丝桃苷溶液2mL于10ml容量瓶中，配成200μg/mL的标准溶液。色谱图见Fig. 2（355nm）和Fig. 3（254nm）。 图2 金丝桃苷的HPLC图（355nm检测） 图3 金丝桃苷的HPLC图（254nm检测） 3.2菟丝子供试品溶液制备 3.2.1提取方法考察 （1）提取溶剂的选择 取菟丝子粉6份（过40目筛）各0.4g，精密称定，置150mL三角瓶中，分别精密加入甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇和40%乙醇各50mL，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，即得，进样10μL，计算提取药材含量。结果见表Tab.1，实验数据表明以上溶剂中60%乙醇对金丝桃苷的提取率最高。表1 对菟丝子提取溶剂的比较表 Solvent MeOH 40%EtOH 50%EtOH 6