Sephadex LH-20 层析原理和应用基础.pdfVIP

摘自Hans Henke 著Preparative Gel Chromatography on Sephadex LH-20 Sephadex LH-20 层析原理和应用基础 1. Sephadex LH-20 同HPLC 和GPC 的比较 低分子量（分子量1000 ）有机化合物在Sephadex LH-20 上的分离不完全是按分子大小的 递减次序。吸附-层析分离是更为重要的。毫不夸大地说，与纯溶剂作为流动相的Sephadex LH20 相比，其它层析分离系统不能显示被分离物质的化学 / 分子结构和其保留行为之间如此多的相 关性。表1 比较和对比了HPLC 和GPC 和Sephadex LH20 观察到的分离机理。这种制成表对比 的概念是在阅读了HPLC 和GPC1）结合的文献后本作者得到的。 事实上，从日常实践中我们早已知道，分子筛层析和吸附层析在羟丙基化的葡聚糖凝胶 (hydroxypropylated dextran gel)上用纯溶剂作为流动相是可行的。 Sephadex LH20 结合HPLC 和GPC 的分离机理并不难懂。换言之，这两种分离都可以在羟 丙基化葡聚糖凝胶上用纯溶剂进行，即SephadexLH20 是一个通用的柱填充材料。在HPLC 中， 无论是在硅胶上，还是在表面改性的硅胶上，每种分离都需要其自己的分离系统，即固定+流动 相。HPLC 几乎总是使用各种梯度的溶剂混合物供选择的分离系统或分离用。现在我们来考虑 在表1 中列举的分离机理的特征。 表1 ↓开始 ↓死时间 t0 A HPLC 分离 无分离 HPLC 分离范围 ← 柱的总死体积 → B 由分子筛层析分离 无分离 排阻区 无分离 (MSC) 按照大小递减分离 C 在A 和B 后在 无分离 排阻和吸附区 吸附区 Sephadex LH-20 Vads 上分离 ↑ ↑ ↑ C=A+B 开始 V0 V0+Vi (加样) ∣ ∣ ∣←V → ∣← V → ∣→→→V + V +V 0 i 0 i ads ∣———————毫升—————————→ 关于A 在 HPLC 中，分离是在死时间 t 后开始，因为这是流动相流经填充有固定相的柱部分的整 0 个长度所需要的时间或洗脱体积，也称为死体积，即间隙体积和孔体积。它只能借助于非保留 物质来测定。换言之，在这一时间之前或这一洗脱体积之前不可能分离。因此，在 HPLC 中， 如果混合物的物质受到不同程度保留 （可逆相互作用）,分离只可在硅胶 （正相）或在表面改性 的硅胶（RP 、CN、NH2 和二元醇相）上进行。 关于B 分子筛或体积排阻层析 （=SEC ）是唯一发生在孔体积V 内按分子大小(分子体积) 降低的次 i 序的分离。在间隙体积V0 内无分离能发生，因为大于凝胶最大孔的所有分子未加分离而被洗脱。 1) W.Winkle,Quantitative An