抗菌肽Lactoferricin B基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

日·q土学厦士学值论文 日·q土学厦士学值论文 作者石芳 导师翟朝阳教授 抗茵胀Lactofe ricin B基圉的免隆理其在太墉杆菌中的融合表连 中文摘要 抗菌肽Lactoferricin B基因的克隆及其在大肠 杆菌中的融合表达 研究生 石芳 导师 翟朝阳 教授 背景与目的Lactoferricin B(简称Lfcin B)是一类富含色氨酸的小分 子抗菌肽，是牛乳铁蛋白(bLf)在消化道内经胃蛋白酶水解而产生。同 其他抗菌肽一样，Lactoferricin B具有广谱杀菌活力，此外可能还有 抑制病毒和真菌增生、抑杀肿瘤细胞等多种生物学功能，而对真核细胞 几乎没有毒性。基于这种选择性效应和无抗原性的特点，Lactoferricin B有望成为新一代的抗菌、抗病毒、抗肿瘤新药。然而，天然抗菌肽的 来源十分困难，无论以何种生物为来源的抗菌肽，都面临培养和提取的 问题，难以保证每一批次的抗菌肽有一致的生物活性，很难满足研究和 临床应用的需要。因此，利用分子生物学技术重组表达外源基因成为获 取目标蛋白的最有效途径。由于抗菌肽对细菌有很强的杀伤作用，不宜 在原核系统中直接表达，一般的策略是采用融合表达或在真核细胞(如 酵母)中进行表达。本研究采用融合表达的方法，体外合成抗菌肽 Ladofcndcin B基因并克隆入大肠杆菌中，重组表达Lactoferricin B 蛋白。 方法根据Lactofcrricin B的氨基酸序列，采用大肠杆菌偏爱密码予反 推其基因eDNA序列，化学合成LactofcrricinB基因，并将基因克隆入 四，q土学磺士学位论文 四，q土学磺士学位论文 怍旨石芳 导师翌朝阳教授 抗茵肤Lactofcrficin B基固的克淹硬其在走肠杆茸中的融合表连 大肠杆菌融合表达载体pGEX一1^T，利用此载体转化大肠杆菌JMl09， 经酶切分析及PCR检测，确定阳性克隆。1PTG诱导阳性克隆表达， SDS—PAGE电泳观察表达产物。表达产物经亲和层析纯化及凝血酶切割， 得到纯度较高的抗菌肽LactofcrricinB，然后检测抗菌肽活性， 结果酶切分析、PCR验证和DNA测序等证实LactoferricinB基因已 被正确地插入pGEX-1^T中。重组表达质粒pGEXl^T-LfcinB在大肠 杆菌JMl09中成功地表达了GST／LfcinB融合蛋白，其相对分子量约为 29x103，表达量约占细菌总蛋白的36％。重组蛋白经亲和层析纯化及凝 血酶切割，获得纯化蛋白。但纯化蛋白未检测出应有的抗菌活性。 结论成功构建了抗菌肽LactoferricinB基因原核表达质粒，捩得了高效 表达的融合蛋白。为进一步探讨Lactoferricin B的抗菌活性奠定了基础。 关键词：抗菌肽Lactoferricin B基因重组融合表达 _川上学厦士学位论文 _川上学厦士学位论文 作者石芳 导师埋朝阳教授 抗茵肚Lactoferricin B基因的克隆度其在走肠杆菌击的融合表连 English abstract Cloning and Fusion Expression ofAntibacterial Peptide LactoferricinB in Escherichia coil Master candidate：Shi Fang Supervisor：Zhai Chaoyang Background＆0bjective LactoferricinB is a 25一residue antimicrobial peptide release by pepsin cleavage of lactoferrin，all 80kDa iron—binding gtycoprotein with many immunologically important functions． Several studies have shown that lactoferricin B has a broad—spectrum activity against various gram-positive and gram·negative bacterial．In addition the peptide has been shown to have antifungal、antiviral activity．Moreover，it is known to bind lipopolysaccharides，thus protecting organisms fiom the harmful effects of sepsis．Moreover，the peptide is apable of stimulating the adaptive il口tm