划碟法倒碟法涂抹法.DOC

劃碟法、倒碟法、塗抹法 目的: 熟悉微生物純種培養的操作方式，學習如何在培養機上分離微生物並得到單一菌落，以及劃碟、倒碟、塗碟等這三種實驗技術。 二.原理: 利用一種以上微生物的混合培養進行培養，表現其群體生存之共同特性，而純種培養是以單一微生物菌種及其衍生細胞進行之，因此純種培養成為各項微生物試驗中最基礎也是最常見的步驟。 此外，純種培養法分為增殖與分離兩種不同的培養程序，前者是由原本混合生長的微生物篩選出我們想要研究或是很感興趣的菌種，例如:厭氧菌的培養。後者為將想要研究的菌種在選擇性培養基當中大量的繁殖，但是有可能會有一些其他的菌種存在其中，所以必須利用到分離的技術，將微生物分成獨立菌落，以達到純種培養的目的。 三.實驗設備: 器材- (二)儀器- 1.錐形瓶 1.電子天平 2.接種環 2.高溫高壓滅菌釜 3.吸球 3.冷藏箱 4.取藥杓 4.微風恆溫培養箱 5.簽字筆 6.玻璃培養皿 7.三腳彎棒 8.酒精燈 9.隔熱手套 10.秤藥紙 11.試管架 四.採樣來源: (一) 採樣來源- 1.工程館前的水池 2.實驗室中的NA培養基 五.操作流程與步驟: (一)劃碟法- 1.先配置NA培養基後加入高溫滅菌釜殺菌。 2.將樣品稀釋，變成稀釋的菌液。 3.用酒精燈去燒接種環以達到滅菌的效果，等冷卻再去沾濃度最高的樣品。 4.以45度角去劃在培養基上，分別為四個不同的地方，但注意不要重複劃在同個位置。 5.等隔天再來看細菌的生長程度並紀錄菌數的多寡。 塗碟法- 取原液1ML加入9ML的無菌水中稀釋，直到十的負三次方倍為止。 使用定量吸管(滅菌過的)吸取各個試管當中的0.2ML，分別滴入1~2滴的菌液在培養皿中。 將酒精中過火滅菌過的三腳彎棒，等冷卻後進行塗抹法，利用旋轉方式均勻的塗在培養皿的四周。 最後倒著放入恆溫培養箱中，等隔天後再來觀察並紀錄實驗的數據。 倒碟法- 1.準備6個無菌培養碁和9ML的稀釋水進行連續稀釋用。 2.再從滅菌釜中拿出的NA培養基，要趁溫度在45度左右，用無菌玻璃定量吸管吸取其他稀釋管之菌液各1ML分別加入無菌培養皿中央。 3.蹈入15~20ML的NA培養基在培養皿中，混合均勻後冷卻凝結。 4.完成後倒著放入恆溫培養箱去培養，隔天觀察紀錄。 六.實驗數據: 1.劃碟法 名稱 原液1 原液2 原液3 原液4 個數 9 11 16 9 原液1 菌數:9 原液2 菌數:11 原液3 菌數:16 原液4 菌數:9 2.倒碟法 名 稱 稀 釋 10-5 稀 釋 10-4 稀 釋 10-3 稀 釋 10-2 稀 釋 10-1 原 液 個 數 6 25 45 75 186 266 10-5 菌數:6 10-4 菌數:25 10-3 菌數:45 10-2 菌數:75 10-1 菌數:186 原液 菌數:266 原水樣菌落數取: 取10-5稀釋次數 6/0.1/10-5 =6 * 10+6 3.塗碟法 名 稱 稀 釋10-5 稀 釋 10-4 稀 釋 10-3 稀 釋 10-2 稀 釋 10-1 原 液 個 數 33 166 174 293 314 345 10-5 菌數:33 10-4 菌數:166 10-3 菌數:174 10-2 菌數:293 10-1 菌數:314 原液 菌數:345 原水樣菌落數取: 取10-5稀釋次數 33/0.1/10-5 = 3.3 * 10^7 七.問題及討論: 1.用這三種分離技術法所得到的實驗結果是否成功分離維生物，即在培養基上形成單一菌落?若沒有單一菌落，請說明失敗原因。 Ans: 有成功，只是並不明顯。(有些較多，有些較少，有些則看不太出來) 2.試述劃碟、塗碟、倒碟法的實驗原理、步驟與實驗中應該要注意哪些事項? Ans: (1)原理- 主要是藉使菌數越來越少，最後達到單獨分離之目的。 (2)步驟- a.倒碟-用接種環連續稀釋，各取1ml的稀釋菌液和固體培養基一起放入以滅菌