抗白菊与TRAIL基因联合应用对大肠癌细胞株DLD1作用的实验研究-肿瘤学专业毕业论文.docxVIP

y巍江天擎匿擎挽磺士学拄论文 y 巍江天擎匿擎挽磺士学拄论文 杭白菊与TRAIL联合应用 对大肠癌细胞株DLDI作用的实验研究 渐江大学医学院 砖科学《肿瘤秘) 研 究 生 张磊 研究生导师 何邋教授 中文摘要 在西方国家，大肠癌的发病率和歹8亡率高居消化道恶性肿瘤的第—位， 在中国近期的§移≤中也表臻，六：晒癌鹪发瘸搴疰逐年上舞。近30年来，虽然 人们对大肠瘸的治疗进行了多方面的探索和努力．但是传统的治疗方法均朱使 大肠癌酶5年生存宰有明显豹改善。基霾治疗是当代瓣癌治疗蜂一个新的 研究领域，它通过各种方法导入不同的目的基因，利用基因产物的功能 壹接或闻按杀死种瘤绥旅。毽目蓠静方法还不麓这捌镪底璃除俸内所有 肿瘤细胞的疗效。联合治疗己成为目前肿瘤基因派疗的发展方向，中医 中药与基因治疗相结合的中西医缀合综合治疗正越来越受别重视。杭臼 菊作为本地中草药特产，其提取液凌含有多种黄酮类化合物，具鸯广泛 的生物学活性，如：抑制多种化学物质的诱变作用； 较强的抗氧化作 矮；提毫动糖戆受嶷功憝；撬程癌殷诱导癣缓魏分纯戆终鼷，{嚣黠茏常 繁殖速率的人体细胞则几乎无影响，其中抗肿瘤作用尤其引人关注。而 瓣瘤坏死鞫子相关静疆亡诱导酝体(Tumor Necrosis Factor-related apoptosis．inducing ligand，TRAIL)作为TNF家族的新成员。具有大量、 快速诱导诵亡的作用，且冀仅诱导转化细胞、肿瘸细胞和病毒感染细胞 发生凋亡，蕊正常细胞能逃逸它的杀伤作用的特性，使得它在辨瘸的基 浙江大学医学院硕士学住论文因治疗中有广泛的应用前景。 浙江大学医学院硕士学住论文 因治疗中有广泛的应用前景。 本实验联合应用杭白菊提取液和端粒酶(hTERT)启动子驱动下肿 瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体基因，作用于人大肠癌细胞株DLD．1， 体外观察联合应用对肿瘤细胞的捅亡诱导及杀伤作用，来探索传统中药 与现代基因治疗联合应用治疗肿瘤的新途径。 材料与方法 实验材料 细胞系：人胚肾细胞株293细胞，大肠癌细胞株DLDI： 腺病毒载体：Ad／hTERT-gTRAIL，Ad／CMV—GFP(载体对照)； 其它：细胞培养材料，各种实验试剂、耗材和仪器等。 实验方法 1)病毒扩增、纯化、鉴定和滴度测定：重组腺病毒Ad／hTERT—gTRAIL 及Ad，CMV—GFP MOI 100感染人胚肾细胞株293细胞，当细胞病变明 显时，收集细胞，反复冻融三次后，用CsCI超速梯度离心法纯化，分 光光度仪在260nm处测OD值换算得病毒滴度。 2)转基因表达检测：将1 X 105个DLDl细胞接种于六孔板每孔，接种 24小时后以MOI 500分别感染Ad／hTERT—gTRAIL、Ad／cMV—GFP(阳性对 照)、各浓度杭白菊提取液(3．75u∥ul、7．5ug／ul、15u∥ul、30u∥ul共4 组)与500MOI的Ad／hTERT—gTRAIL混合组、各浓度杭白菊提取液 (3．75u∥ul、7．5u∥ul、15u#ul、30u∥ul共4组)与500MOI的 A彤CMV—GFP混合组、各浓度杭自菊提取液组(3．75u#ul、7．5u∥ul、 15u∥ul、30u∥ul共4组)和PBS(空白对照)，感染后48小时，收集细 胞，流式细胞仪检测GFP表达。 3)细胞生长曲线：将5×l∥个DLDl细胞接种于96孔板每孔，接种后 澎江走擎垂警耱磺士擘垃静文24小时，将细胞分为6大组：MOI 澎江走擎垂警耱磺士擘垃静文 24小时，将细胞分为6大组：MOI 500感染Ad／hTERT-gTRAK．组； MOI500感染A影CMV—GFP组：器稀浓度杭自菊撬取液缀(3．75ug／ul、 7．5ug／ul、15ug／ul、30ug／ul其4组)；各浓度杭白菊提取液(3．75ug／ul、 7．5ug／ul、15ug／ul、30ug／ul共4组)与500MOI的Ad／hTERT—BTRAIL 混念组；各浓度杭瞧菊提取渡与500MOI的Ad／cMv《FP混合组穰空 白对照组(PBS组)。每～缀设立4个平行孔，在感染后的48小时，用 MTT法溅轰缀细胞生长撩铡率。 4)凋亡检测：6孑L板每孔接种DLDl细胞1×105个，接种后24小时， 选褥缩蕤努笼6太缀： MOI 500潦綮Ad／hTERT-gTRAIL鳃；MOl 500 感染A彤CMV—GFP组；各种浓度杭白菊提取液组(3．75ug／ut、7．5u∥ul、 15ug／ul、30ug／ul共4缀)；各浓度杭囱菊提取液与500MOI的 Ad／hTERT*龋RAIL混合缌；各浓度杭臼菊提取滚与500MOI的 A彤CMV．GFP混合组和空白对照组(PBS组)。随后每天用倒置盛微镜 理察细腿形态