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几种常用生物活性测试方法简介 CONTENTS 细胞水平活性测试方法 等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) 基本原理： 注：H 为受体（主体），G为配体（客体），Ka为结合常数 △Go为Gibbs自由能变化，△Ho 为焓变，△So 为熵变 受体-配体复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。 ITC仪结构示意图 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC是一种热量连续变化的量热器。主要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池)和参比池、注射器和一台计算机组成，注射器同时具有搅拌作用，计算机控制温度控制装置和信息反馈系统。 Methods In Cell Biology, 2008, 84,79. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC数据图 Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289. 左图： 横坐标：时间 纵坐标：热功率 峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。右图： 横坐标：滴定物与样品溶液的摩尔比 纵坐标：滴定产生的总热量 反应过程的结合等温曲线 ITC独特之处： 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由软件分析ITC得到的数据。 量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。 ITC的用途：获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩尔结合焓(△H）、摩尔结合熵（ △S）、摩尔恒压热容（ △ Cp），和动力学参数(如酶活力（Kcat）、酶促反应米氏常数(Km)) 。 可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞相互作用等方面。 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) surface plasmon resonance , SPR 表面等离子共振（SPR）原理 消逝波：当入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质，透过光疏介质的波被称为消逝波。 等离子波：当金属受电磁干扰时，金属内部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，电子不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行震荡，并以波的形式表现。 surface plasmon resonance , SPR 表面等离子共振原理 光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会形成消逝波进入到光疏介质中与介质中存在一定的等离子波相遇时可能会发生共振。当消逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。 SPR角：反射光完全消失的角。 SPR角随金属表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与金属表面结合的分子质量成正比。 可通过 SPR 角的变化捕获生物反应过程中生物分子之间相互作用的特异信号，对待测物质进行测定直接测量反应平衡常数 Ka，解离平衡常数 Kd 等。 surface plasmon resonance , SPR 将待测分子键合在生物传感芯片表面，使其形成分子敏感膜， 再将分析物分子溶液注入，使其以恒定流速流过芯片表面，如果两者通过相互作用而结合，则将引起生物传感器表面质量的增加， 导致传感器表面折射率的变化，从而引起SPR角的改变。 SPR被广泛应用于分析生物分子如蛋白质-蛋白质、药物-蛋白质、蛋白质-核酸