哺乳动物细胞传代培养.PDFVIP

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 哺乳动物细胞传代培养 随着细胞基因工程的不断发展 ，目前有多种生物表达系统都能够大规模的生产重组蛋白 ，主要分为原核和真核两类。 真核表达系统又包括 ：酵母表达系统 ，哺乳动物细胞表达系统 ，昆虫杆状病毒表达系统。相比之下 ，哺乳动物细胞 表达系统最突出的优点是能够促进蛋白的正确折叠和糖基化等翻译后修饰 ，从而保证蛋白的天然活性 ，目前已成为 表达和生产部分蛋白药物、基因工程抗体等目的蛋白的首选宿主。 哺乳动物蛋白表达常用的细胞有 HEK293 （人胚肾细胞 ）和 CHO （中国仓鼠卵巢细胞 ）。这两种细胞的应用最为广 泛 ，是在真核蛋白表达系统中最常用的细胞 ，具有以下特点 ： 1. 具有准确的转录后修饰功能 ，表达蛋白在任何方面都最接近天然状态 ； 2. 具有重组基因的高效扩增和表达能力 ，外源蛋白整合稳定 ； 3. 具有较高的耐受剪切力和渗透压能力 ，表达水平较高 ； 4. CHO属于成纤维细胞 ，是一种非分泌细胞 ，自身很少分泌内源蛋白 ，有利于目的蛋白的分离纯化 ； 5. HEK293细胞具有更高的生长密度更快的生长速度 ，易培养 ，易转染。 本文主要对 HEK293细胞及 CHO细胞传代培养的基本原则、实验步骤及注意事项进行介绍。 细胞培养基本原则 合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是细胞传代培养最重要的条件 ，培养基不仅提供给细胞在体外生长繁殖需要的基础物质 ，还维持 细胞生长的整个环境 ，不同的细胞有不同的生长习性 ，因此要选择合适的培养基。 优质血清 目前 ，多数的合成细胞培养基都有添加血清 ，常用的血清有小牛血清、马血清等。血清中含有细胞生长所必须的生 长因子 ，作为哺乳动物细胞培养的附加物 ，血清十分昂贵且存在多种问题 ，因此人们在不断寻找可以替代血清的物 质。 Tel (025) 5889-4959 www.DetaiB Sales@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 无毒无菌的生长环境 体外生长的细胞缺乏对微生物和有毒物质的抵御能力 ，一旦被污染 ，会导致细胞死亡。因此在进行细胞传代培养时 ， 无毒无菌的培养环境是必要条件。 温度与气体环境 细胞生长需要恒定的温度 ，同时气体（氧气与二氧化碳 ）也是哺乳动物细胞培养的所必须的物质 ，HEK293和 CHO 的细胞培养条件一般是 37℃ ，5%的二氧化碳环境。 细胞传代实验流程 细胞复苏 1. 提前将水浴锅打开 ，预热 37℃。 2. 细胞培养基提前预热 ，5-10ml于 15ml离心管中。 3. 把冻存细胞立即投入 37℃水浴锅中 ，轻微摇动 ，待融化后 （大概 1-1.5min ），取出。 4. 用 75%乙醇消毒管外壁 ，放入超净台,转移到含 5-10ml培养基的 15ml离心管中 ，离心 800-1000rpm ，5min。 5. 去掉上清 ，加入完全培养基重悬细胞 ，转移到培养皿中 ，前后左右轻轻摇动 ，使培养皿中的细胞分散均匀。 6. 标记好细胞名称 ，代数 ，日期 ，培养基等 ，放到 37℃的 5% CO2培养箱中培养。 7. 贴壁细胞培养一般第二天就可以贴壁 ，根据细胞生长速度 ，2-3天换一次培养基。 8. 离心可能对某些细胞造成伤害 ，这些细胞可以不离心 ，只需要将 DMSO 的浓度降到 1%以下即可。（一般冻存 液中 DMSO浓度为 10% ，即 1ml冻存细胞需加 9ml培养基。） 细胞传代培养 1. 当培养皿中的细胞覆盖率达到 80%-90%时需要进行细胞传代。 2. 吸掉培养皿中的旧培养液。 3. 用 5ml PBS洗涤细胞 1-2次。 4. 用 1ml 的trypsin（胰酶 ）溶液 ，37℃作用数分钟 ，于倒立显微镜下观察 ，当细胞呈圆形即将分离时 ，吸掉 trypsin 溶液。（若不去掉 trypsin溶液