微生物学检验第3版微生物接种技术检专.ppt

临床微生物检验基本技术 汤丽霞、何印蕾 费世杰、何　涛 目录 一、目的要求 二、实验材料 三、实验方法 （一）接种与分离工具 （二）接种与分离方法 （三）细菌的培养方法 四、实验内容 1、掌握常用接种与分离方法。 2、掌握需氧培养方法。 3、掌握无菌操作基本技术。 1、 接种环、接种针、涂布棒、吸管、酒精灯。 2、培养基（上次实验配制的）。 3、恒温培养箱。 接种与分离工具 （1）接种环 （2）接种针 （3）涂布棒 （4）无菌棉拭子 1．平板划线分离法 2、斜面接种法 3．穿刺接种法 4．液体接种法 5．倾注平板法 6．涂布接种法 1．平板划线分离法 　 对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。平板划线分离法通常有两种方法： （1）分区划线分离法 （2）连续划线分离法 （1）分区划线分离法： 此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。 Ⅰ.划线时接种环与平皿约成30-40度角，轻轻接触，以腕力在琼脂表面轻快滑动，不能划破琼脂。 Ⅱ.第一次划线应占平皿面积的1/5，以后每次划线约占面积的1/4—1/5。 Ⅲ.划线为连续划线，不能间断应占满平皿，划线不能交叉重复。 Ⅳ.每次划完后接种环应灭菌。 （2）连续划线分离法： 此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。 （二）接种与分离方法 （二）接种与分离方法 2、斜面接种法 主要用于菌落的移种，以获得纯菌种进行鉴定和保存菌种等。 1.普通斜面: 用接种环挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。 2.高层斜面：用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上底部向上划一条直线，然后由下至上曲折划线接种。 斜面划线分离法： （二）接种与分离方法 3．穿刺接种法 此法多用于半固体培养基或明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。 　　接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。 （二）接种与分离方法 4．液体接种法 用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。 （二）接种与分离方法 5．倾注平板法 本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。 （二）接种与分离方法 6．涂布接种法 本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。 涂布接种法 根据不同的标本及不同的培养目的，可选用不同的培养方法。通常把细菌的培养方法分为需氧培养、二氧化碳培养、微需氧培养和厌氧培养四种。???? 三、革兰氏染色的原理与步骤 （1）革兰氏染色的原理 　　　革兰氏染色法，是细菌学中最经典的染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。根据细菌细胞壁的组分和结构不同，通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为两大类G+和G-。 　　G+菌呈紫色 　　G-菌呈红色　　 　　　 革兰氏染色的原理 　　　革兰氏染色的原理尚未完全阐明。目前主要有细菌等电点、化学结构及细胞膜通透性等三种学说: 　　　①革兰氏阳性菌等电点在PH2~3，比阴性菌(PH4~5)为低，因此阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌强. 　　　②革兰氏阳性菌含有核糖核酸镁盐,易和结晶紫-碘复合物结合而不易脱色. 　　　③革兰氏阳性菌细胞壁及细胞膜的通透性较低。因此，染料和碘的复合物不易为乙醇所溶出，所以阳性菌仍保持原来的紫色,而阴性菌染成的紫色可被酒精脱掉后复染成红色。 革兰氏染色的原理 　　　具体方法是：标本固定后，先用结晶紫初染，再加碘液媒染，使之生成结晶紫－碘复合物；此时不同细菌均被染