实验3重组质粒DNA提取及双酶切鉴定.ppt

1. 质粒DNA提取 2. 限制性内切酶切割重组质粒;实验目的;预习：基因克隆示意图;基因克隆操作过程： ;基因载体（gene vector）;基因载体应具备特点;基因载体类型;一.质粒DNA的制备;(1)质粒的定义 质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋(supercoil)形式存在。 ;;② 开环DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。;③ 线状DNA(linear DNA,L DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？） ;(3)质粒DNA的一般特性： ①质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 ②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。 ③它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。;2 提取质粒DNA的常规方法: 2.1 核酸分离纯化的总原则： ? 保证核酸一级结构完整 ? 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）;3.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤;3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA 3.1 实验原理： ①在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA断裂成不同长度的双链DNA。;②强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离； ③当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去。;④如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质。;3.2 主要试剂及作用; 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成 ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） ;溶液III：HAC和KAC组成的高盐溶液(复性作用) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕并使质粒DNA复性。 ②KAC会与SDS溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。; 实验步骤及注意事项;注意事项： 1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型（pUC119-U6 ）； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤。;二、限制性内切酶切割重组质粒;作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome);Bam HⅠ;影响限制酶活性的因素;pUC18/19酶切位点的分布示意图;2 BamHI 、HindⅢ酶切重组质粒及鉴定;;2 实验材料: 重组质粒; BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶;反应缓冲液;琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备。;3 实验步骤: A 建立反应体系 B 酶切反应（温育1-3h） C 电泳鉴定;4、双酶切体系（0.2mlEP管）： 质粒DNA 10μl 10×M buffer 2μl BamHⅠ 1μl HindⅢ 1μl ddH2O