免疫组化双重染色技术.pptVIP

* 第八章. 免疫组化双重染色技术 (Double staining technology in immunohistochemistry) 用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示两种或两种以上的抗原, 以发现其定位, 形态和功能上的相互关系. 一. 连续切片双重染色法 A. 最简单最可靠. 用同样的免疫组化方法, 在两张相邻切片上各显示一种抗原, 然后比较. 由于每张切片上只进行一次染色, 所以不会互相干扰或出现假性双标记. B. 切片厚度1~3?m. 如果较厚如神经组织切片(10~20?m), 可以采用“镜像”法, 即相邻切片翻转后贴在载玻片上, 或利用软件PS. 二. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的抗体, 染色后观察, 相应的抗原物质显示不同的颜色. A. 直接法: 1. 一步法: 将FITC (490~495→520~530nm, 黄绿色荧光)和TRITC (550→620nm, 红色荧光)分别标记的两种抗体按一定比例混合, 使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片. 2. 二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片. 3. 观察: 同一个视野里. a. 对每一种荧光标记物(绿色或红色)使用不同的滤色板进行观察和照相, 每张照片显示一种荧光, 比较两张照片. b. 两种荧光重叠照相, 则在一张照片上可发现分别含不同抗原的细胞(呈绿色或红色), 如果两种抗原存在于同一个细胞或结构, 则呈现两种红绿荧光的混合色, 如黄色. 免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色, 混合色为黄色. B. 间接法: 1. 两种一抗不标记, 但来自不同种属的动物如兔和豚鼠. 2. 两种来源于同种动物或不同种动物的二抗(如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗 兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以FITC和TRITC标记. 3. 染色程序: a. 先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第一种抗原; 然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第二种抗原. b. 将两种一抗混合后孵育切片, 再将两种标记的二抗混合后孵育切片, 最后用荧光显微镜观察. 免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色, 混合色为黄色. Y.W Lin. USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594 in COS7 cells. Nuclei were stained by Hoechst blue 三. 免疫酶双重染色 A. 单酶法: 1. 原理: a. 用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原, 但用不同的电子供体如 DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物. b. 两种一抗来自同种属动物, 两重染色之间需将第一次染色反应中的各级抗体和酶或各级抗体, 酶和反应产物从组织上洗脱. c. 连续做两次染色, 所费时间较长. 抗体, 酶和反应产物洗脱 2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合适的抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次序: a. 先显示含量较少的抗原. b. 先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原. c. 先用不太敏感的抗体. d. 先用DAB显色. 4. 对照试验: a. 单染对照. b. 在进行第二次染色前, 要证明第一次染色的各级抗体和酶活性被完全除去, 而且洗脱后对第二个待检抗原无影响. 5. 抗体洗脱: a. 酸洗法: pH2.2甘氨酸-HCl缓冲液(可加入适量二甲基甲酰胺, DMF)1~4小时使抗原-抗体复合物解离. b. 氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10~260, 1分, 氧化除去抗体, 0.5% Na2S2O5漂白液脱色. 第一次染色用CN显色, 并注意对第二种抗原的影响. c. 甲醛蒸气法: 1升容器+3g多聚甲醛+切片, 置80℃烤箱1~4小时, 蒸汽破坏抗体的Ig结合部位. 第一次用ABC法, 氧化法洗脱抗体. 对照试验证实此为假性双标. 6. 具体操作步骤: a. 方法1: 第一次染色后, 除去抗体和酶而使有色反应终产物留在抗原部位, 再用同样方法进行第二次染色. *. 切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭同前. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗两次, 每次5~10分. *. 氧化法洗脱. TBS洗如上. *. 用PAP法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS洗如上. 甘油胶封片. 一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色 大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色)和生长激素细胞(棕色