棉花分生组织转化技术的研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

Research on Technology of Cotton Meristem Transformation A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Natural Science By Yin Xiu (Biochemistry and Molecular Biology) Dissertation Supervisor: Associate Professor Cui Bai-ming June, 2013 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除 文中已经注明引用的内容外 ，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。 有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 棉花分生组织转化技术的研究 棉花分生组织转化技术的研究 棉花分生组织转化技术的研究 棉花分生组织转化技术的研究 I I 摘 要 近年来大多研究学者通过植物转基因技术改良棉花性状，已成功获得了多种优良品 质的转基因棉花。大多采用农杆菌介导法、基因枪法及花粉管道法，其中关于农杆菌介 导的棉花遗传转化的研究颇多且研究机理较清楚。 农杆菌介导的棉花遗传转化体系通常以下胚轴为外植体，经历组织培养的过程获得 再生植株。但该遗传转化体系通常受到基因型限制、转化周期长、成胚率低等因素的限 制。棉花茎尖分生组织具有发育成完整植株的能力，不受品种的限制及实验周期短。本 文在前人的工作基础上对棉花茎尖分生组织遗传转化体系进行改良。 目的：高速涡旋的玻璃粉创伤新陆早 33 成熟棉胚的茎尖分生组织，利用农杆菌介导法 将 gusA 报告基因导入棉花，通过检测评估该方法的转化效率，探讨不同的转化条件（不 同菌株、不同浓度、不同侵染方式、玻璃粉量及涡旋时间）对该方法遗传转化的影响。 方法：棉花种子消毒后在无菌条件下用手剥离出棉胚，去除子叶后完全暴露出茎尖分生 组织且不受损伤。2 mL MS 液体培养基、玻璃粉及棉胚转至 10 mL 离心管，3000 rpm 高 速涡旋创伤成熟棉胚后用农杆菌介导法侵染，设置了不同的单因素转化条件：两种菌种、 三种菌液浓度、不同侵染方式、三种不同玻璃粉量及两个涡旋时间。GUS 组织化学染色 部分棉胚及石蜡切片观察棉胚转化情况，余下棉胚筛选培养出幼苗，移栽后对幼苗叶片 进行卡那霉素初步筛选、PCR 检测及 GUS 组织化学染色。 结果：农杆菌 LBA4404 与 GV3101 分别侵染棉胚，GUS 染色发现农杆菌 LBA4404 转化 棉胚后较多细胞能被着色。GUS 染色发现菌液浓度 OD600 为 0.8 时棉胚的较多细胞被着 色，能表达 gusA 的活性。采用不同的方法侵染棉胚，GUS 染色发现方法 1 转化棉胚后 较多细胞能被着色。玻璃粉量越大对棉胚的损伤越严重，即插入棉胚的玻璃粉量越多， GUS 染色发现 0.2 g 玻璃粉转化条件下棉胚及茎尖分生组织较多的细胞被染成蓝色。随 着玻璃粉量加大，幼苗成活率降低，0.2 g 玻璃粉转化条件下成活 12 株幼苗，比较适宜。 涡旋时间越长对棉胚及茎尖分生组织损伤越严重，即插入棉胚的玻璃粉量越多，成苗量 下降，涡旋 90 s 转化条件下成苗量较低，但转化效率有所提高，获得 2 株 GUS 阳性苗。 将染色后的棉胚石蜡切片后发现茎尖分生组织被染色且多层细胞能被着色。移栽成活 78 株幼苗，成活率为 72.2%，用高浓度（200 g/L）卡那霉素筛选幼苗叶片，筛选效果不明 显。PCR 检测到 3 株幼苗能扩出 494 bp 条带，GUS 染色叶片后未被着色，为假阳性。 结论：农杆菌 LBA4404 转化效果较好；菌液浓度 OD600 为 0.8 时转化效果较好；方法 1 的侵染效果较好。不同玻璃粉量及涡旋时间越长对棉胚及茎尖分生组织损伤越严重，越 难以发育出幼苗，但涡旋时间越长有利于转化。对幼苗检测后未获得转基因植株，该方 法转化效率较低。 关键词：棉花茎尖，农杆菌介导法，基因