第2章章节 基因工程 上(西南大学 普通生物学)资料.ppt

M13mp18 7429bp 含有8kb大小的双链DNA病毒 3、CaMV基因克隆载体 花椰菜花斑病毒（CaMV） 最大装载大于CaMV-DNA 300bp 由缺陷型CaMV同辅助病毒组成。缺陷型CaMV 仅具病毒少数功能基因，而辅助病毒携带其他CaMV基因。 （1）CaMV载体的构建 互补载体系统 把组装有外源DNA的CaMV-DNA插入Ti 质粒载体，通过根癌农杆介导，转移到植物细胞内。 混合载体系统 CaMV的DNA在植物中高水平转录35S RNA，其启动子是一强启动子。 CaMV 35S 启动子融合基因载体系统 将不含启动子的外源目的基因组装在35S启动子的下游，构建成可在植物中高效表达的载体。 　　感染啮齿动物细胞后，病毒DNA可整合到寄主细胞的染色体DNA上。 4、SV40载体 SV40病毒 一个含5243bp环状双链DNA的猿猴空泡病毒40 用外源DNA分子取代SV40中部分DNA （1）SV40(Simian Virus 40)载体的构建 取代型重组病毒载体 晚期取代型 早期取代型 分为 SV40不能包装大于原DNA的重组DNA分子 用SV40的部分DNA片段与质粒重组而成 重组型病毒质粒载体 进入细胞后，RNA反转录DNA，通过两端的长末端重复序列（LRT）整合到染色体DNA上，成为原病毒。 4、反转录病毒克隆载体 反转录病毒（retrovirus） 一类RNA病毒 三、柯斯质粒（cosmid） “cos site-carrying plasmid”缩写而成。 1、柯斯质粒 人工构建的含有λDNA粘性末端位点（cos）序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 Cosmid pJB8 Cosmid c2XB 克隆外源DNA的柯斯质粒可高效转导对λ噬菌体敏感的寄主细胞，进入细胞后可环化（cos位点），因不含全部λ噬菌体DNA的基因，不能进入溶菌周期 2、柯斯质粒的特点 1）具有λ噬菌体的特点 具质粒的复制子，能够像质粒一样进行复制，具抗菌素抗性基因 插入的外DNA片段可达30kb 以上 2）具有质粒的特点 3）具有高容量的克隆能力 （site-specific homologus recombination） 四、染色体定位整合载体 1、靶位 受体细胞基因组中外源DNA定位整合的DNA区域（位置）。 2、基因打靶（gene targeting） 基因定位同源重组 自主复制序列（一个或多个） 五、人工染色体克隆载体 1、酵母人工染色体 染色体（ Chromosome ）的结构元件 着丝粒 端粒（两个） 具有酵母的着丝粒序列、自主复制序列、端粒序列 Ampr MCS 酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome , YAC） 可接受100~ 1000kb的外源DNA片段。 多克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因 YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具 2、细菌人工染色体(Bacteria Artificial Chromosome , BAC ) 细菌细胞内能自我构建复制的质粒，约100kb，它能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段 F因子 氨苄青霉素（Ampr，Tn3 ） pMB1 （类似 Col E1质粒，具大肠杆菌素E1合成酶基因） 四环素抗性（Tetr，pSC101 ）基因 复制原点 选择标记基因 多克隆位点（multiple cloning site） 　　TcR内有11个限制性内切酶位点，其启动子内2个 　　64个限制性内切酶位点 　　ApR内有6个限制性内切酶位点 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶 α-肽链的DNA序列(lacZ基因) （2）pUC质粒载体 Messing Vieria （University of California）1987年构建 pBR322质粒的复制起点（ori） 氨苄青霉素抗性基因（ampr） lacZ 内有13个酶切位点的多克隆位点。 pUC18 pUC19 X-Gal is a noninducing chromogenic substrate for beta-galactosidase, which hydrolyzes X-Gal forming an intense blue precipitate. X-GaI is most frequently used in conjunction with IPTG in blue/white colony screening to detect recombinants (white) from non-recombinants (blue) X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-