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蛋白印迹——Western blot 实验流程及注意事项 各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰 度以至蛋白的亲疏水性等。此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。 Western blot 技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首 先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特 异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。 印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋 白的一个重要步骤。 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE 或SDS） 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE （Polyacrylamide gel electrophoresis ），是以 聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯 酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用 方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP ）为催化剂，以 四甲基乙二胺（TEMED ）为加速剂。在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生 自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生 甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE 根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统 电泳体系中缓冲液pH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷 和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度 的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩 效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、 浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP 催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为 pH6.7 的Tris -HCL。分离胶是由AP 催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2 种孔径的凝胶、2 种缓冲体 系、3 种pH 值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH 值、缓冲液离子成分的不连续 性，这是样品浓缩的主要因素。 实验步骤 1. 配制分离胶5ml （配方见图1）； 2. 将液体用1ml 移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不 要产生气泡）； 3. 用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了， 影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）； 4. 大约1 小时后（也可以第一天晚上配好分离胶过夜，第二天一早配制堆积胶）， 配制堆积胶1ml。 5. 倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子； 6. 约1 小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）； 7. 将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液； 8. 拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer 混合变性的蛋 白；①蛋白上样量：20-50μ g ；②上样缓冲液：加入 5 ×SDS 上样缓冲液至 终浓度为 1 ×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般 我们用的上样最大体积在30ul 左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中 煮 5-10min 使蛋白变性。可以使用 PCR 仪进行变性，99℃5 分钟，加快速 度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管 容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量； 9. 在电泳槽中加入电泳缓冲液； 10. 恒压80V 30 分钟，100V 2 小时左右，溴酚蓝跑到底即可 （电泳时间可以根 据自己目的蛋白的具体条件设置，一般 4～5 h，电压为 40V 较好，也可用 60V 。）； 图1 配胶说明 液体配制 1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g