生物化学实验...docVIP

生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部  实验一 酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理 ． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机 2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计 ． 四、试剂与材料 1、牛奶 2500mL 2、95％乙醇 1200mL 3、无水乙醚 1200mL 4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液 3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液 2000mL 五、操作 将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)，弃去上清液。 在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％) 得率： 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。 休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。 本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。 三、器材 1.25mL刻度试管 2. 吸管 3.离心管 4.乳钵 5.分光光度计 6.恒温水浴 7.离心机 四、试剂和材料 1、小麦种子 2、o.1％标准麦芽糖溶液 精确称量100mg麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。 3.pH6.9，0.02mol/L磷酸缓冲液 0.2mol/L磷酸二氢钾67.5mL与0.2mol/L磷酸氢二钾82.5混合，稀释10倍。 4、1％淀粉溶液 1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸缓冲液中，其中含有0.0067mol/L氯化钠。 5、1％3，5—二硝基水杨酸试剂 将1.00g3，5—二硝基水扬酸溶于20ml 2M L1NaOH溶液和50ml水中，加入30g酒石酸钾钠定容至100ml。 6、1％氯化钠溶液 五、实验操作 1、种子发芽 小麦种子浸泡2.5小时后，放入25℃恒温箱内或在、室温下发芽。 2、酶液提取 取发芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳钵内，加入1%氯化钠溶液10mL，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。然后将提取液离心（1500r/min）6—7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将发芽第3或第4天的幼苗稀释10倍。 取干燥种子15粒作对照（提取步骤同上）。 3、酶活力测定 （1）取25mL刻度试管4支，编号。按下表要求加入各试剂（各试剂须在25℃预热10分钟） 试管标号 试剂 1 2 3 4 干燥种子的酶提取液 发芽第3或第4天的幼苗的酶提取液 标准管 空白管 酶液（mL） 0.5 0.5 — — 标准麦芽糖溶液（mL） — — 0.5 — 1％淀粉溶液（mL） 1 1 1 1 水（mL） — — — 0.5 将各管混匀，放在25℃水浴中，保温3分钟后，立即向各管加入1％3，5—二硝基水杨酸溶液2mL。 （2）取出各试管，放入沸水浴加热5分钟。冷却至室温