课件：寨卡等蚊虫传播传染病实验室检测策略.ppt

蚊虫标本病毒分离—研磨 操作场所：二级或三级生物安全实验室 个人防护：防护服、口罩、帽子、乳胶手套 研磨器要插入冰浴中进行预冷 整个操作过程中蚊虫标本都要保存在冰浴中 蚊虫标本病毒分离—研磨 1 2 3 4 1、从冰浴中取出研磨器和蚊虫标本 2、从研磨器中拔出研磨杵 3、将蚊虫标本倒入研磨器中 4、向研磨器中加入1ml研磨液 蚊虫标本病毒分离—研磨 5 6 5、旋转研磨器快速反复研磨 6、直至蚊子大的组织块消失 7、使用毛细管将研磨液吸出 8、将研磨液加入无菌1.5ml EP管中 7 8 蚊虫标本病毒分离—研磨液离心 要使用冷冻离心机 4℃ 12,000 rpm 离心20min 3 装有研磨液上清的EP管要迅速插入冰浴中 蚊虫标本病毒分离—仪器研磨 时间短，效率高，可节省人力物力 有利于病毒存活，提高病毒的分离率 动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄） 优点，很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离 但是，小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果 组织培养分离法： 没有隐性感染 没有免疫能力的抵抗力 接种量大 培养条件易于控制 加速病毒的分离过程 C6/36：对蚊传虫媒病毒较为敏感，蚊传虫媒病毒分离的首选细胞 BHK-21：对绝大多数虫媒病毒敏感 BHK-21 C6/36 蚊虫标本病毒分离—常用分离方法 蚊虫标本病毒分离—感染细胞 1、吸出离心后研磨液上清 2、将研磨上清液加入到细胞管中 3、感染后的细胞培养管 4、放入孵箱中孵育1h （C6/36 在28℃孵育，BHK在37℃孵育） 1 2 3 4 蚊虫标本病毒分离—感染细胞 5、倒掉研磨液 6、使用无血清培养基洗1-2次 7、加入1ml含1%血清的维持液 8、培养1周，并逐日观察CPE 5 6 7 8 蚊虫标本病毒分离—观察细胞病变 重复上述过程，连续接种三代，观察是否出现连续稳定的细胞病变 C6/36细胞 ：融合，聚集 BHK细胞 ：圆缩，脱落 蚊虫标本病毒分离—乳鼠分离 对三日龄乳鼠颅内接种蚊悬液上清 观察有无拒乳、震颤、强直等症状 如果出现上述症状，要将鼠脑进行研磨，并将鼠脑研磨液继续往下接种，连续接种三代，直到获得病毒分离物 六、 疟疾 相关定义： 疟疾（malaria）:疟原虫寄生于人体引起的传染性寄生虫病，包括见日疟、恶性疟、三日疟、卵形疟。 重症疟疾：出现脑损伤、胃肠损伤、严重贫血、溶血、异常出血、严重肝肾损伤、休克等严重并发症。 带虫者：血中有疟原虫而无临床症状。 传播途径与媒介：按蚊叮咬或输血。 临床 潜伏期：长短不一，12d-30d,长者可达1年。 前驱期：发作钱3-4d,疲乏、头疼、不适、畏寒。 发作期：先后周期性出现寒战、发热、出汗退热等症状，多次后可见脾肿、贫血。 血象：红细胞和血红蛋白在多次发作后下降，恶性疟尤重；白细胞总数初发时可稍增，后正常或稍低，白细胞分类单核细胞常增多，并见吞噬有疟色素颗粒。 诊断 1.流行病学 有在疟疾流行区居住或旅行史，近年有疟疾发作史或近期曾接受过输血的发热患者都应被怀疑。 2.临床表现 典型的周期性寒战、发热、出汗可初步诊断。不规律发热，伴脾、肝肿大及贫血，应想到疟疾的可能。流行区婴幼儿突然高热、寒战、昏迷，也应考虑本病。 3.实验室检查 （1） 血涂片查找疟原虫：通常找到即可确诊。在寒战发作时采血，此时原虫数多、易找。需要时应多次重复查找。并一定要做厚血片寻找。如临床高度怀疑而血片多次阴性可做骨髓穿刺涂片查找。 （2）聚合酶链反应（PCR）查核酸：灵敏性和特异性均较高。PCR检测方法已在原来的基础上发展成多种方法，除可以直接检测血样中的疟原虫外，还可以检测滤纸干血滴上的疟原虫。 （3）胶体金、ELISA法疟原虫抗原 敬请指导 谢谢大家 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 病原检测 核酸检测 BSL-2 常规RT-PCR/琼脂糖凝胶电泳 实时荧光定量PCR (TaqMan) 分离病毒BSL-3 细胞培养: Vero, BHK, C6-36, 其他 小鼠 抗体检测 IgM（ELISA、IFA) IgG（ELISA 、IFA) 中和抗体（PRNT,定量分析） * 病原检测比较 核酸 IgM抗体 IgG抗体 中和抗体 1. 与其他黄病毒无交叉，一经明确即可确诊2. 低敏感性 3.需要重复，不同基因组位置 1. 最常用急性期感染检测 2. 第一