检测两种蛋白质间相互作用.docVIP

检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。 缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。 缺点是转膜前需要将蛋白复性。2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。3. 双杂交技术 原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。 缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。5. 荧光共振能量转移技术 指两个荧光法色基团在足够近（100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。 缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。 酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母 表达质粒的 转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合 结构域基因和 转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统 酵母双杂交的原理是，把报告基因 HIS3 和 l a c Z 整合到酵母细胞基因组中，并受转录因子GAL4 的调控表达。一旦 GAL4 蛋白结合到 HIS3 和 l a c Z 调控序列相应的位点，则启动报告基因的表达。通过检测报告基因的表达判断阳性或阴性。实际应用中，把 GAL4 基因分成两个部分： DNA 结合区（ gal4 DNA binding domain, GBD）和激活区(gal4 activating domain, GAD）。分别把 GBD 和 GAD 构建到两个不同的载体上，并能表达相应的两个融合蛋白（ GBD-X 和GAD-Y）。然后把 GBD-X 和 GAD-Y 两种载体共转染到带有报告基因的酵母细胞中。当 GBD-X融合蛋白中 X 蛋白与 GAD-Y 融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时（或结合在一起时），就使得原本分开的 GBD 和 GAD 蛋白靠近并具有完整的 GAL4 蛋白的功能，从而能够激活报告基因的表达。（ 1） 筛选相互作用的蛋白酵母双杂交技术能用于对 cDNA 文库的筛选。把你要研究的蛋白亚克隆到 GBD 载体上，作为“诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚克隆到 GAD 载体上。然后就可以在文库中寻找那些能够与“诱饵”蛋白可以相互作用的蛋白。也许你能够筛选到多株阳性克隆。虽然酵母双杂交技术具有广泛的应用价值，但正如任何其它技术一样，酵母双杂交技术也有一定的局限性。酵母双杂交技术最大的弱点就是假阳性出现率。所以筛选到的阳性克隆需要进一步的鉴定和功能数据支持。（2） 确定参与结合作用的结构域或 motif当你确定了两个蛋白质分子之间有相互作用后，利用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白质分子中那些结构起结合调节作用。你可以先把一个蛋白进行随机缺失，制备一系列缺失体，然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力的大小，直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用的氨基酸序列（称为结构域或 motif）。如果一个蛋白分子中具有已知的结构域或 motif，也