利用Sanger测序使CRISPR和TALEN基因组编辑工作流程更便捷.PDF

应用说明 GeneArt基因组编辑 利用Sanger测序使CRISPR和TALEN基因组 编辑工作流程更便捷 在本应用说明中，我们阐述了以下内容： CRIS PR-Cas9技术来源于细菌适应性免疫系统。它是一 • 毛细管电泳Sanger测序法可用于测定原代转化培养物中 种双组份系统，依赖于可切割双链DNA 的酶(Cas9)和可将 的基因组编辑效率 酶引导至正确基因组位点上的向导RNA (gRNA) 。如果不 提供修复模板，则酶造成的断裂会被易错非同源末端连接 • Sanger测序可有效验证转化培养物中成功的基因组编辑， (NHEJ)过程修复。这会产生异源细胞群体，它们的用户自 以及筛选二级克隆中的成功编辑事件 定义断裂位点周围存在不同插入或缺失。该过程可用于生 • Applied Biosystems™ Minor Variant Finder软件可用于测 成敲除特定基因的细胞株。或者，如果提供修复序列，可 定从传代培养物分离出的克隆中的SNP改变频率 利用修复序列作为模板，修复断裂位点周围的序列。通过 选择作为修复模板的序列，可在基因组内的用户自定义位 引言 点引入精准的序列改变。 自从DNA 的双螺旋结构被发现，研究人员已开发了操作 DNA 测序的技术。然而，在用户自定义位点引入精确的 然而，为获得带有同源基因组编辑的克隆种群，需要对来 序列改变，仍然是一项艰巨繁复的挑战。在这方面，研究 自细胞原代转化池的多个克隆进行筛选。这需要进行两 人员利用寡核苷酸、小分子或自剪切内含子已经取得了 轮筛选。首先，通过初次筛选确定含有编辑的细胞的相对 一定的成功，但定点锌指核酸酶(ZFN)和TA L效应物核酸酶 比例。确定编辑效率后，将能够确定单细胞克隆的数量， (TA LEN) 的开发促进了序列特异性操纵。然而，由于蛋白 它们需要被分离并扩增。接下来，通过二次筛选识别来源 设计、合成和验证中的困难，减慢了这些工程化核酸酶作 于具有所需编辑的单细胞的克隆。在两个筛选阶段，均可 为常规应用的普及速度。最新的基因编辑技术-CRISPR- 采用毛细管电泳(CE) Sanger测序法获取信息。多年来， Cas9系统-在很大程度上克服了这些难题[1] 。实际上， Sanger测序因其简单、经济的工作流程和简单的数据分 CRISPR-Cas9系统已被证明是一种简单且经济的方法，一 析，成为序列测定的金标准。通过CE产生的数据，可清晰 位研究者提出该技术带来了 “基因靶向的民主化”[2] 。因 识别序列改变，并检测到一个种群中的混合单核苷酸多态 此，CRISPR-Cas9系统正时刻准备着改革基因组编辑。 性(SNP) 。基于上述原因，毛细管电泳Sanger测序是所有 基因组编辑工作流程中很有价值的一部分。 工作流程概述 设计和合成 转染细胞 检测成功编 建立单细胞 筛选用于编辑 鉴定成功的 T hermo Fisher Scientific 已整合了基 gRNA 辑率 克隆 的克隆 编辑 因编辑和下游分析所需的所有工具 ( 图1) 。Inv it rogen™ GeneA rt ™设计 工具有助于设计和订购用于CRIS PR 基因组编辑的靶向g R NA s 或用于 GeneA rt Gibco培养 TOPO克隆试 Gibco培养基 A pplied 适用于您的系 TA LEN基因组编辑的TA L。Invitrogen CRISPR搜