细菌视紫红质基因的克隆及鉴定_重组质粒论文.doc

PAGE 3 武汉东湖学院 生物技术综合实验论文 细菌视紫红质基因的克隆及鉴定 基因重组实验——视紫红质bop基因的克隆 PAGE 1 摘 要 本实验室通过将视紫红质目的基因（即bop基因）导入pUC18质粒制备得到重组质粒，再将该重组质粒导入到大肠杆菌DH5α细胞中进行克隆，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验实现了视紫红质目的基因（即bop基因）的克隆。 本次实验，通过老师提供的大肠杆菌DH5α（含pUC18质粒）菌种平板和大肠杆菌DH5α（不含pUC18质粒）菌种平板进行接种后对比，在氨苄青霉素选择性培养基的筛选作用下，得到了含pUC18质粒的大肠杆菌DH5α；通过SDS碱裂解法制备得到了pUC18质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定；以实验室老师所提供质粒为模板，进行PCR扩增得到目的基因（带BamHⅠ和HindⅢ 的酶切位点），并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化；在限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ 的作用下，得到酶切后的pUC18质粒和目的基因，并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化；在T4DNA连接酶的连接作用下，制备出重组质粒；通过氯化钙制备得到感受态大肠杆菌DH5α细胞；在42℃短时间的热冲击处理（热休克）下，重组质粒被感受态大肠杆菌DH5α细胞所摄取，随着大肠杆菌DH5α 为了鉴定重组质粒确实含有视紫红质目的基因（即bop基因），并确实被感受态大肠杆菌DH5α细胞所摄取，并随着大肠杆菌DH5α细胞的增殖而克隆。首先通过SDS碱裂解法提取重组质粒；通过以重组质粒为模板， PCR扩增得到目的基因；然后在1％琼脂糖凝胶电泳中，通过与Maker蛋白的电泳条带对比，进行初步鉴定，得出我们所提取的重组质粒中含有视紫红质目的基因（即bop基因）。为了进一步确定结果，在限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ 的作用下，我们对重组质粒进行酶切；在琼脂糖凝胶电泳中，通过与Maker蛋白的电泳条带对比，进一步确认出，我们通过大肠杆菌DH5α细胞所克隆得到的重组质粒，确实就是导入了视紫红质目的基因的pUC18质粒。 本次实验的结果：（1）第一次碱裂解法提取质粒后电泳鉴定时，只得到了一条不成带形的“脱尾”亮带，所处位置大致在1.5～2.0kb，推测出这段亮带是不完整的被打断的质粒；第二次碱裂解提取质粒后电泳鉴定时，根据亮带所处位置，其碱基数在1.9kb左右，推测出闭合环状的pUC18质粒。（2）PCR扩增得到的目的条带，碱基数在1.2kb左右，亮度较大，带形较宽且连续，推测出该条带是扩增产物，且浓度较大并且纯度较高；在该目的条带下方，出现了模糊的涂抹带，推测出该条带可能是PCR非特异产物带；在碱基数为110bp左右，出现一条模糊带，推测出该条带可能是“引物多聚体”带，也可能是非特异性序列带。（3）经限制性内切酶 BamHⅠ和 HindⅢ处理后，电泳只得到了一条亮带，且亮带处于2.１kb左右，即推测为pUC18质粒。（4）通过SDS碱裂解法提取质粒，电泳只得到一条亮带，碱基数在2.2kb左右，推断是重组质粒；通过以重组质粒为模板，PCR扩增电泳得到一条亮带，碱基数在1.2kb左右，推断是目的基因；有“彗星”尾出现，推断是由于没有加入RNA酶。（5）酶切之后的产物出现两条亮带，根据开环pUC18质粒碱基数在2.1kb左右，酶切后的目的基因碱基数在1.1kb左右，并与酶切之前的重组质粒亮带对比，推测出上面一条带是开环pUC18质粒，下面一条带是酶切后的目的基因。 本次实验的结论：我们通过大肠杆菌DH5α细胞所克隆得到的重组质粒，初步确认就是导入了视紫红质目的基因的pUC18质粒；有关视紫红质目的基因的性状表达，应做进一步的实验鉴定。 关键词：视紫红质基因；pUC18质粒；基因克隆；大肠杆菌DH5α 目 录 TOC \o 1-3 \h \z \u HYPERLINK \l _Toc16421 摘 要 l _Toc19710 1.前 言 l _Toc25634 1.1基因工程技术 l _Toc32347 1.1.1 基因工程的建立与基本概念 l _Toc1713 1.1.2基因工程的四大要素 l _Toc18139 1.1.3基因工程的应用进展 l _Toc8270 1.2 PCR技术 l _Toc5587 1.3 细菌视紫红质基因的结构功能与应用 l _Toc150 1.4 实验原理 l _Toc11143 1.4.1 SDS碱裂解法制备质粒及电泳鉴定 l _Toc16755 1.4.2 感受态细胞的制备 l _Toc29223 1.4.3 转化子的筛选 l _Toc9367 整个基因重组试验的基本流程图 l _Toc11214 2.材料和方法 l _Toc13825 2.1 培养基配制、灭菌、无菌接种 l _