苏云金素合成基因簇中非核糖体肽合成酶基因thu2功能的-生物资源.PDF

氨基酸和生物资源 2014，36（1）：0~0 Amino Acids Biotic Resources 苏云金素合成基因簇中非核糖体肽合成酶 基因thu2 功能的初步分析 罗春平，李俊花，徐子雅，彭东海，阮丽芳 （华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070 ） 摘要：对苏云金素生物合成基因簇中编码非核糖体肽合成酶基因thu2 进行基因缺失插入失活的研究。用温敏型质粒 pHT304-TS 构建基因thu2 的插入缺失质粒pEMB 1434 ，电转化苏云金芽胞杆菌菌株CT-43 后，通过抗性筛选和PCR 验证得 到thu2 基因同源双交换基因敲除突变株CT-43-22 。HPLC （高效液相色谱，High Performance Liquid Chromatography ）检测发 现CT-43-22 没有苏云金素特征吸收峰；用pHT304 构建得到含有完整thu2 基因的回补质粒pEMB 1435 ，电转化CT-43-22 后得到互补重组菌CT-43-22b ，发现其恢复了苏云金素的产生。显微镜观察突变株和互补重组菌均能产生正常的晶体和芽 胞。thu2 的基因敲除和基因互补实验证明，thu2 基因为CT-43 苏云金素生物合成的必需基因，但对晶体和芽胞的形成没有 影响。 关键词：苏云金素；非核糖体肽合成酶；基因敲除；温敏型质粒 中图分类号：Q 754 文献标识码：A 文章编号： PreliminaryAnalysisoftheNonribosomalPeptideSynthetase Genethu2 intheThuringiensinBiosynthesisCluster LUOChunping，LIJunhua，XuZiya，PENGDonghai，RUANLifang （State Key Laboratory of Agricultural Microbiology ，Huazhong Agricultural University ，Wuhan 430070 ，Hubei ，China ） Abstract：Thuringiensin is a small molecular weight nucleotide insecticidal toxin produced by some strains of Bacillus thuringiensis and secreted into extracellular supernatant. This work ，on the base of revelation of the thuringiensin biosynthesis clus- ter in strain CT-43 ，preliminary analyzed the function of gene thu2 in the cluster. Bioinformatics analysis indicated that thu2 was a nonribosomal peptide synthetase. We constructed plasmid pEMB 1434 for thu2 knockout with temperature sensitive shuttle plasmid pHT304-TS and obtained the thu2 knockout mutant CT-43-22. HPLC detection found that the CT-43-22 could not produce thuringi- ensin. Then ，we constructed plasmid pEMB 1435 harboring intact thu2 and obtained the recombinant CT-43-22b after the pEMB 1435 was electroporated. The CT-43-22b could restore the production of thuringiensin. Microscopic examination