PKCδ激活对肝细胞内质网应激和脂肪变性的调控作用.doc

第三军医大学硕士学位论文 PKCδ激活对肝细胞内质网应激和脂肪 变性的调控作用? 摘 要 研究背景和目的： 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)在近几十年已经成 为常见的公共健康问题。NAFLD 包含了从单纯性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 的临床疾病状态，能发展为肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。目前广泛接受的理论是“二 次打击”学说，该学说认为，以胰岛素抵抗为首的“一次打击”是引起肝细胞脂肪变 性的主要原因，在此基础上，以内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、线粒 体功能障碍为标志的“二次打击”导致了单纯性脂肪肝向 NASH 的演进。 ERS 在 NASH 肝细胞损伤中发挥重要作用，是目前的研究热点，但机制不明。结 合免疫球蛋白 Bip, 又称 GRP78 或 HspA5, 是位于内质网中重要的分子伴侣,被认为是 内质网应激标志性蛋白之一。剪切型 X 盒结合蛋白 XBP-1s(spliced X-box binding protein 1) 不 仅 可 以 与 内 质 网 应 激 的 反 应 元 件 (endoplasmic reticulum stress response element , ERSE)结合诱导 Bip、C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)基 因 的 转 录 活 性 ， 而 且 能 够 诱 导 内 质 网 降 解 增 强 因 子 - α 甘 露 糖 苷 酶 样 蛋 白 (ER degradation-enhancing-mannosidase-like protein，EDEM)基因的转录，因此 XBP-1s 表达上调被认为是内质网应激的另一标志 。 蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)是存在于哺乳动物细胞胞浆内的丝/苏氨酸蛋白 激酶，具有脂质依赖性,至少包括 12 种亚型。PKCδ 是新型 PKC( novel PKC, nPKC)家 族成员，主要在肝脏组织中发挥作用。与 cPKC 和 aPKC 不同，PKCδ 能被游离脂肪酸 的代谢产物二酰甘油(diacylglycerol，DAG)激活，并通过激活应激活化蛋白激酶(c—jun N—terminal kinase，JNK)和 CHOP，促进肝细胞凋亡的发生。研究发现，PKCδ激活 与糖尿病及其相关疾病发病机制密切相关。将编码 PKCδ 的 Prkcd 基因经整体或者肝 特异性敲除后，小鼠肝脏胰岛素敏感性得到明显改善。与高脂饮食饲养野生型同窝对 照小鼠相比较，Prkcd-/-小鼠肝脏和血浆甘油三酯水平及附睾脂肪组织都减少。这些线 索提示：在 NASH 发生发展过程中，PKCδ 参与肝细胞脂肪变性过程，其激活很可能 ? 本课题受国家自然科学基金资助 6 万方数据 第三军医大学硕士学位论文 是诱导 ERS 持续发生导致肝细胞脂肪变进展至 NASH 发生的关键环节，但目前尚无 PKCδ 与 ERS 之间关系的研究。因此，本研究目的在于初步探讨 PKCδ 与肝细胞脂肪 变性、内质网应激的关系，为防治非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)向 NASH 的演进提供新思路。 方法： 构建肝细胞株 L02 脂肪变性体外模型 人正常肝细胞株 L02 培养于含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，造模前细胞 进行胎牛血清剥夺过夜。对照组培养于含 1% FAF-BSA 的 DMEM 培养基培养，脂肪 酸组给予 0.5mM 长链游离脂肪酸(long-chain fatty acids，LCFA)，油酸/棕榈酸酯，2:1。 根据诱导脂肪变的时间，脂肪酸组分为 2h 组、4h 组、8h 组和 16h 组。 油红 O 染色检测各组细胞内脂滴含量。 检测各组细胞内甘油三酯(TG)含量。 2 Real-time PCR 检测 PKCδ、Bip、XBP-1s 的 mRNA 水平的表达变化。 3 Western-blot 检测 PKCδ、Bip、XBP-1s 在蛋白水平的表达变化。 4 检测 PKCδ 对内质网应激标志蛋白 Bip、XBP-1s 的影响。 利用 siRNA 瞬时转染技术降低 PKCδ 基因的表达。 检测干扰 PKCδ 表达后 Bip、XBP-1s 的 mRNA 水平的表达变化。 检测干扰 PKCδ 表达后 Bip、XBP-1s 的蛋白水平的表达变化。 5 检测干扰 PKCδ 表达后对 L02 肝细胞脂肪变性程度的影响。 6 利用 SPSS18.0 软件，对各项实验数据进行统计学分析。 结果： 1 油酸/棕榈酸(2:1)体外诱导成功建立