第四章酶联免疫测定法.ppt

基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 第一章 概述 1 标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等）进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中的标记物，这种免疫技术，称为标记免疫技术. 2 标记免疫技术的分类： ⑴按标记物分类：同位素标记 荧光素 酶标记 等等 放射免疫技术 放射免疫技术是利用放射性核素的可探测的灵敏性、精确性，抗原抗体反应的特异性组合而创建的一类免疫测定技术 医学生物学超微量分析的里程碑。 放射免疫技术分为： 放射免疫分析 免疫放射分析 放射免疫分析的测定原理 Ag + Ab Ag – Ab + Ag （待测品） Ag – Ab 放射免疫技术的应用 放射免疫技术的特异性强、精密度好，灵敏度高（10-9-10-15 g/L），对半抗原和抗原的测定及仪器设备条件要求不高，是基层医院测定超微量物质的主要手段，常用于各种激素、微量白蛋白、肿瘤标记物和药物等微量物质的检测。 放射免疫技术的缺陷 放射性核素半衰期短，试剂有效期短， 通常为一个月。 由于标记物的不断变化，使试剂批间、批内差异大，标准曲线无法保存备用。 放射免疫使用放射性核素标记，需要一定的防护及废物处理措施。 结果测定依靠时间的累计，至少每一样本一分钟。 无法进行自动化分析 第二节 酶联免疫法 免疫酶技术：酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。 一 、酶免疫测定法的概念和分类 把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。将酶与抗体或抗原用交联剂结合起来，形成酶标抗体或抗原。这种抗原或抗体与体内或者固相上的抗体或抗原特异性结合，加入相应的酶底物时，底物被酶催化生成有色产物，根据呈色深浅来判断待测抗原或抗体的活性和浓度。 均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法。异相法 则需分离后测定 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。用于定量测定。 竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） ELISA方法类型及应用 双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法，适用于检测两个以上抗原决定簇的多价抗原。 间接法：是测定抗体最常用的方法。 竞争法：可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。 第四节 ELISA的技术要点 过碘酸氧化法 （三）酶标抗体的鉴定 1．酶标抗体的活性鉴定 一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。2．酶结合物的定量测定 包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。 分光光度法 P74 二、反应条件的选择 酶标抗体浓度： 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 温度、时间等 10μg/ml 　 　 　 1:1000 1.17 0.15 0.09 1:5000 0.46 0.03 0 1:25000 0.12 0 0 1μg/ml 　 　 　 1:1000 ＞2 0. 25 0.10 1:5000 0.91 0.12 0.01 1:25000 0.25 0.01