利用CDK抑制剂-SU9516体外生产猪孤雌激活四倍体囊胚-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文.docxVIP

学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标记和致谢的部分外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得任何教育机构的学位或学历而 使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。 研究生签名： 日期：j匈生』：目遗目 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下所完成的学位论文，学校有权保存其电子和纸制文档j可 以借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送交并 授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密论文，按 保密的有关规定和程序处理。 本学位论文属于： 1．保密 o，在 ；2．不保密y厂 研究生签名： 日期：弛缝萼且 万方数据 摘要摘要 摘要 摘要 现如今，四倍体广泛的应用在动物繁殖技术领域中，特别是在干细胞中利用 四倍体和二倍体制备嵌合体来研究动物胚外组织缺陷。通过不同的技术有多种四 倍体囊胚的制作方法，但是不同制备方法都存在不同程度的优缺点，需要不断开 发新的四倍体制备方法。因此，本研究使用一种新型细胞周期性依赖激酶 (cyclin-dependent kinase，CDK)抑制剂SU9516体外高效诱导猪孤雌激活 (parthenogenetie activation，PA)四倍体囊胚。SU9516可以通过抑制猪PA 胚胎第二极体的排出以及抑制中心体复制两方面来体外制备猪PA四倍体囊胚。 同时，SU9516可以通过抑制CDKI活性间接降低MPF活性来提高猪PA胚胎体外 发育能力。本研究主要包括以下几个实验： 一、SU9516体外制备猪PA四倍体囊胚。 试验1：电激活猪胚胎之后，在猪PA胚胎体外培养液中添加不同浓度SU9516促 进猪其体外发育能力。结果表明：添加10嘲SU9516与其他浓度(1州，5嘲，100 州)及素对照组5¨g／ml细胞松弛(cytochalasin B，CB)相比可以显著地提高 猪PA胚胎体外发育能力(47．5％VS．26．2％，28．9％，40．6％，and 25．8％，P0．05)。 用最佳浓度(101-IM)SU9516处理不同的时间后观察胚胎体外发育能力，结果表明： SU9516处理4 h猪PA胚胎具有最好的体外发育能力(47．5％vs．39．096，33．7％，and 39．1喻。 试验2：电激活猪PA胚胎之后，分别利用添加lO嘲SU9516或5 pg／ml CB的 体外培养液中处理2 h后观察猪PA胚胎第二极体的排出情况。结果表明：10州 SU9516组，5 pg／ml CB组与未处理组相比显著地降低了第二极体的排出率 (14．o％，13．8％VS．78．8％P0．05)。为了确定囊胚的染色体组数，对SU9516 组合、CB组处理后获得的猪PA囊胚进行核型分析。结果显示：SU9516处理组的 囊胚中四倍体率显著地高于CB处理组(55．8％VS．14．0 P0．05) 试验3：为了进一步确认不同处理组中猪PA囊胚的染色体组数。利用Hoechest 万方数据 摘 摘 要 33342染色不同处理组中的细胞数目。结果表明：SU9516处理组中囊胚细胞数显 著地低于CB组以及6-DMAP组(34．4±17．56 VS．46．4±10．58，45．1±10．68)。 二、SU9516抑制MPF活性提高猪PA胚胎体外发育能力。 实验1：分别检测10州SU9516和5 pg／ml CB处理猪PA胚胎4 h后MPF表达 活性。结果显示：SU9516处理下的猪PA胚胎MPF活性水平显著地低于CB组(103．2 pg／m]VS．131 pg／m1)。 总结：1、1)SU9516处理提高猪PA胚胎体外发育能力最佳条件为10州，4 h。 2)SU9516可以抑制猪PA胚胎第二极体排出和诱导猪PA四倍体囊胚。 3)SU9516处理可以显著地降低猪PA囊胚细胞数。 2、SU9516通过对MPF活性的改变来提高猪PA胚胎体外发育能力。 关键词：猪；SU9516；孤雌生殖；囊胚：四倍体；成熟促进因子 万方数据 垒垒呈!堡垒!Abstract 垒垒呈!堡垒! Abstract Tetraploid embryos have been widely used in animal reproduction including production mice from embryoniC stem cells(ESCs) and tetraploid：diplo