课件：0409蛋白质1-1-2-1.ppt

离子交换柱层析（ion-exchange column chromatography） 树脂先用含Na的缓冲液处理成钠盐，且pH在2左右，将氨基酸混合液（pH2-3）上柱，氨基酸此时是阳离子，与树脂上的钠离子交换，被固定在树脂上。 作用力：（1）静电吸引，（2）氨基酸侧链与树脂基质(聚苯乙烯)的疏水作用力 用氨基酸自动分析仪分析氨基酸混合物的洗脱曲线（阳离子交换剂）。 洗脱的先后顺序取决于氨基酸的所带电荷与离子交换树脂的静电吸引和疏水相互作用两者的综合作用的结果。 1. 用强酸型阳离子交换树脂分离下述氨基酸,当用pH7.0 的缓冲溶液洗脱时,下述每对中先从柱上洗脱下来的是哪种氨基酸?(1) 天冬氨酸和赖氨酸; (2)精氨酸和甲硫氨酸; (3) 谷氨酸和缬氨酸 (4)甘氨酸和亮氨酸; (5)丝氨酸和丙氨酸 解析与要点: 用离子交换树脂分离氨基酸主要根据氨基酸所带电荷不同, 另外还和氨基酸的极性有关. 2. Lys, Arg, Asp, Glu, Thr和Ala 的混合物在高pH值时，加到阴离子交换树脂上，用连续递减的 pH值溶液洗脱时，预测这些氨基酸的洗脱顺序 解答：这些氨基酸的pI 分别是：Arg 10.76， Lys 9.74, Thr 6.53, Ala 6.0, Glu 3.22, Asp 2.97。在高pH值时均带负电荷，与阴离子树脂发生交换而结合到柱子上，随着洗脱液的 pH值逐步降低，首先是Arg 的净电荷变为零而先被洗脱下来 ，同理其它氨基酸的洗脱顺序： Lys , Thr, Ala, Glu, Asp THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 （四）氨基酸的化学性质 氨基酸是离子化合物，但在溶液状态时，存在 下列平衡： 化学反应中可用左边的结构式表示氨基酸。 氨基酸分子的α-氨基、α-羧基能参加反应，有的侧链R基团也能参加反应 1. α-NH2参加的反应 A. 酰化反应 ①酰化试剂：苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、对-甲苯磺酰氯。这些酰化剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基保护剂。 ②丹磺酰氯（DNS-Cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯） DNS—Cl可用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。 N Gly—Ala—Ser—Leu—Phe C →→→→ N DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—Phe C 水解 DNS—Gly、 Ala、 Ser、 Leu、 Phe DNS-氨基酸在紫外光激发后发黄色荧光。 ③（生物体内）在酶和ATP存在条件下，羧酸也可与氨基酸的氨基作用，形成酰基化产物。 苯甲酸与Gly的氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用的一个典型的例子。 苯甲酸是食品防腐剂，在生物体内转变成N-苯甲酰-Gly后，可经尿排出。 B. 烷基化反应 α-氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。 Sanger反应（2,4一二硝基氟苯，DNFB或FDNB） 二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸。 Edman反应（苯异硫氰酸酯，PITC） 苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸） → 苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸） PTH-氨基酸，无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸 含硫氨基酸的烷基化反应 硫原子也是亲核中心，可发生亲核取代反应。 生物体内，最重要的甲基化试剂是S-腺苷甲硫氨酸（SAM），是由Met与ATP作用得到的S-烷基化产物。 在酶催化下，SAM可以使多种生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰胆碱的生物合成。 S-腺嘌呤核苷-高半胱氨酸（比Cys多一个-CH2） C. 形成西佛碱反应 西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应如转氨基反应的中间物。 氨基酸的α-氨基能与醛类化合物反应生成弱碱，即所谓西佛碱（Schiff’s base）。 D.与甲醛的反应 用NaOH滴定 氨基酸甲醛滴定法 判断蛋白质水解或合成的进度 E. 与亚硝酸的反应 在标准条件下测定生成的N2体积，即可计算出氨基酸的量。 用途：范斯莱克（Van Slyke）法测定氨基氮的基础。可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。 F. 与荧光胺反应 荧光胺 荧光产物 荧光产物激发波长 λx = 390 nm , 发射波长 λM = 475 nm , 该反应非常灵敏（1ng），可根据荧光强度εM测定氨基酸含量 G. 脱氨基反应 经相应的氨基酸氧化酶、转氨酶催化的反应。 2、α-羧