Burkholderia sp.ZYB002产脂肪酶条件优化及脂肪酶基因克隆.pdfVIP

福建师范大学 硕士学位论文 Burkholderia sp.ZYB002产脂肪酶条件优化及脂肪酶基因克隆 姓名：张岩峰 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：黄建忠 摘要 摘要 筛选到一株对有机溶剂有较高耐受性的产脂肪酶菌株Burkholderia sp．ZY-B002， 利用响应面法优化了产酶发酵条件；克隆得到了其脂肪酶基因和伴侣蛋白基因，并 对二者进行了生物信息学分析。主要研究内容及结果如下： (1)以罗丹明B为指示剂筛选产脂肪酶菌株，其中ZYB002发酵酶活最高，在 30％(V／V)的苯中仍可生长。该菌株对氨苄青霉素、卡那霉素、四环素具有天然的 抗性，而对氯霉素敏感。16SrDNA序列分析表明该菌株与Burkholderia cenocepacia 其活性，而Ca2+则有一定的激活作用。 (2)单因子实验确定最适碳源、氮源、诱导剂、发酵周期、培养温度等。添加 Triton 素；设计爬坡实验逼近了最大产酶区；进行响应面中心组合设计对这三个因素进行 优化。发现双水相萃取方法提取脂肪酶的效果优于硫酸铵沉淀。 。 存在跨膜疏水区；含有脂肪酶伴侣蛋白超家族保守区域。以DNAstar分析了二者的 二级结构分布情况，以S、ⅥSS—MODEL分析了二者的三级结构。 关键词脂肪酶，Burkholderia sp．，筛选，响应面法，克隆，生物信息学 中文文摘 中文文摘 微生物脂肪酶是一类重要的工业酶，种类多、来源广、生产周期短、pH和作用 温度范围广、对底物具有专一性，具有较高的催化活性和稳定性，可在有机相中进 行催化反应。其中假单胞菌脂肪酶具有高立体选择性、底物专一性、位置选择性和 较高的转酯活性，广泛应用于洗涤工业、食品加工、药物合成、手性拆分、生物能 源等各个领域，是理论和应用研究的热点。 筛选优良的产脂肪酶的假单胞菌菌株是一项重要且必须的基础性工作。罗丹明 B是一种筛选脂肪酶产生菌的有效指示剂，不受pH值的制约。本研究从筛选脂肪酶 产生菌着手，利用油脂同化平板进行筛选，得到了细菌1l株、真菌20株。摇瓶复筛 以ZYB002菌株活性最高，以之为进一步研究对象。该菌株生长曲线具有典型的细菌 生长特征；对氨苄青霉素、卡那霉素、四环素具有天然的抗性，对氯霉素敏感；在 菌株的16SrDNA序列。将该序列进行同源性检索，结果表明该菌株16SrDNA基因与 Burkholderia Burkholderia cenocepacia进化关系最为密切，定名为Burkholderiasp．ZYB002。 不同条件下检测酶活发现，ZYB002菌株所产脂肪酶在70C时出现最高酶活力。 其酶活性具有极大的抑制作用，而Ca2+则有一定的激活作用。 为了获得较高的脂肪酶产量，本研究对Burkholderia sp．ZYB002进行了发酵优 化。通过培养基单因子实验确定了糊精、牛肉膏、大豆油分别为最适碳源、氮源、 诱导剂。大豆油可以增加其rnRNA总量，而使产酶量增加。发现培养基中添力flTdton X．100可提高产酶量。通过培养条件单因子实验确定了发酵周期为22／J,时，培养温度 产酶温度以不高于30。C为宜，不同于大肠杆菌等其它细菌的发酵温度。ZYB002菌株 对