鲤疱疹病毒2型ddPCR检测方法的建立及其抗体库的筛选-水产养殖学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文2．3讨论 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2．3讨论 ．20 第三章抗CyHV-2噬菌体单链抗体淘选及鉴定 22 3．1材料与方法 22 3．1．1主要实验材料 22 3．1．2主要试剂和溶液配制 22 3．1．3噬菌体展示文库的扩增 24 3．1．4噬菌体展示文库的拯救 24 3．1．5淘选抗CyHV一2的单链抗体 24 3．1．6鉴定阳性克隆 25 3．1．7测定阳性克隆序列 26 3．1．8可溶性单链抗体的诱导表达 26 3．1．9测定可溶性单链抗体的分子量 26 3．1．10可溶性单链抗体与CyHV．2和变性CyHV．2的结合特性分析 ．26 3．1．11可溶性单链抗体的特异性分析 ．27 3．1．12亲和力常数测定 ．27 3．1．13免疫组化技术使用抗体P1A5和P3A5检测CyHV．2在异育银鲫体 内的分布 27 3．2结果与分析 29 3．2．1抗CyHV。2单链抗体库的淘选结果 29 3．2．2阳性克隆的鉴定结果 29 3．2．3阳性克隆序列的测定结果 31 3．2．4可溶性单链抗体分子量的测定结果 32 3．2．5可溶性单链抗体的结合特性分析结果 33 3．2．6特异性及亲和力常数的测定结果 34 3．2．7抗体P1A5和P3A5测定CyHV．2在异育银鲫肝和鳃组织中的分布 结果 ．34 3．3讨论 ．35 参考文献 37 硕士期间发表的论文 44 致{射 45 II 万方数据 鲤疱疹病毒2型ddPCR方法的建立及其抗体库的筛选摘要 鲤疱疹病毒2型ddPCR方法的建立及其抗体库的筛选 摘要 鲤疱疹病毒2型(Cyprinidherpesvirus 2，CyHV-2)，是一种高致病性双链DNA 病毒。因该病毒是第2个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒，国际病毒系统分类与命名 委员会(ICTV)将其命名为鲤疱疹病毒2型，该病毒属于鱼疱疹病毒科 (Alloherpesviridae)，鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)。本研究建立了定量检测 CyHV-2的微滴式数字PCR(droplet di西tad PCR，ddPCR)方法，并且与实时荧光 定量PCR(read-time quantitative PCR，RT-qPCR)方法就其灵敏性、特异性、重 复性和临床样品检测作了比较分析。结果表明，与RT-qPCR相比，ddPCR具有 相同的特异性，其灵敏性比RT-qPCR方法低20倍。在定量CyHV-2 DNA时， ddPCR(R2=0．994)和RT-qPCR(R2=O．994)均表现出良好的线性关系，并且这 两种检测方法的定量值呈正相关(R2=O．989)。但是，在定量检测相同稀释度 CyHV-2 DNA时，RT-qPCR的定量值始终比ddPCR高10倍。ddPCR的组内和 组间重复变异系数(CV)各为0．59％一11．26％和6．55％．23．21％，而RT-qPCR各 为16．57％．27．56％和22．31％．56．73％，说明ddPCR具有更好的稳定性。在临床样 品定量检测时，ddPCR的检出率稍高于RT-qPCR。本研究建立的ddPCR能够准 确定量检测CyI-IV-2，将为CyHV-2相关研究提供有益参考。 为获得可检测CyHV-2的单链抗体，本研究利用噬菌体抗体库技术，经过4 轮淘选富集后获得2株抗CyHV-2单链抗体(scFv)。Dot blot结果分析表明，2 个可溶性单链抗体均能特异性识别CyHV-2；Western blot结果显示，2个可溶性 单链抗体的分子量约为27 kDa。由免疫组化试验结果可知2个可溶性单链抗体 均能检测到CyHV-2在肝组织和鳃组织中的分布。ELISA试验结果表明可溶性单 链抗体均不与CyHV-3、EHNV、CCV、ISNV发生交叉反应。本研究期望能为 CyHV-2的快速检测提供借鉴，并为CyHV-2检测试剂盒的研发奠定基础。 关键词：鲤疱疹病毒2型；噬菌体展示；微滴式数字PCR；单链抗体；荧光定量 PCR；定量检测 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文Abstract 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 Abstract CyHV-2(Cyprinid herpesvirus 2)is a double—stranded DNA virus．It is the second herpesvirus isolated from Cyprinid，is named Cyprinid herpesvirus 2(CyHV-2) according to the rules of Intemational Committee on Taxonomy of Vir