原位杂交技术原理与应用.pptVIP

* * * * * 从理论上讲，核苷酸杂交的有效反应时间在3h左右。但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16～20h。当然，杂交反应的时间与核酸探针长度与组织通透性有关。 　　有作者主张杂交反应的孵育应在黑暗环境中进行，因为光线会促进甲酰胺的电离作用。 4．杂交严格度（Hybridization stringency） 杂交条件的严格度（stringency）表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。错配对(mismatch）杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。 杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低。一般来说，低严格度（low stringency）杂交及冲洗条件在Tm -35℃至Tm –40℃之间，高盐或低甲酰胺浓度。在这种条件下，大约有70%～90%的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交信号的产生。中严格度，Tm -20℃至Tm-30℃的范围。高严格度（high stringency）为Tm-10℃至Tm-15℃，低盐和高甲酰胺浓度。在这种条件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。　　 由于原位杂交技术多数是在Tm-25℃进行的，不属于高严格范围，无疑会产生非特异性结合导致信/噪比减低。在这种情况下，可用加强杂交后处理洗涤的严格度使非特异性的杂交体减少。由于RNA杂交的稳定性，应用cRNA探针进行细胞或组织的原位杂交时的杂交温度比其它核酸探针要高10～15℃。实验证明，cRNA产生的信号比双链cDNA要强。单链的RNA探针其杂交信号大于双链的cDNA的约8倍。 5．硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide） 硫酸葡聚糖是核酸杂交液中仅次于甲酰胺的一种组成成份。在杂交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它具有极强的水合（hydrate）作用，能大大增加杂交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。这是应用硫酸葡聚糖于杂交液中的主要目的。 　　甲酰胺的主要作用在调节杂交反应温度方面，从而有助于保持组织的形态结构。甲酰胺还可防止在低温时非同源性片段的结合，但甲酰胺具有破坏氢键的作用从而具有一种不稳定的作用。 （四）杂交后处理（post hybridisation treatment） 　　杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。 通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。 在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。 洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。 必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。 （五）显示（Visualization） 　　显示又可称为检测系统（Detection system）。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。 　　细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪（computer – assisted image analysis）检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或图像分析仪对不同类型和数量的核酸的显色强度进行检测。 （六）对照实验和ISHH结果的判断 　　和其它实验方法一样，并非ISHH的任何阳性信号都是特异性的，故必须同时有对照试验以证明其特异性。对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试验有下列几种 ISHH对照试验一览表 核乳胶或非放射性检测系统对照试验 Northern 或Southern印迹杂交法 ISHH与免疫细胞化学结合 应用多种不同的核苷酸探针与同一靶核酸进行杂交 将cDNA或cRNA探针进行预杂交（吸收试验） 与非特异性（载体）序列和不相关探针杂交（置换试验） 将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交 应用同义RNA探针（Sense probe）进行杂交 以不加核酸探针杂交液进行杂交（空白试验） 组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行ISHH对照 应用未标记探针做ISHH，进行对照 从理论上讲，对照试验设置愈多其靶核苷酸特异性确定愈可靠，但现实是不可能的。因此，在上述对照试验中应任选设至少3～4种用以证实ISHH结果的可靠性。 比较可靠的对照试验: Northern 和Southern印迹杂交法。 用结合的免疫组织化学和ISHH法从蛋白质（或多