第01章蛋白质的结构与功能（2）.PPT

目 录 （五）超速离心 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 根据转速分类：常用离心机 10 000 rpm 高速离心机 20 000~25 000 rpm 超速离心机 50 000 rpm 蛋白质纯度的鉴别标准 可通过电泳或层析的方法鉴定蛋白质纯度 纯度是相对的。 1.在不同pH条件下电泳，蛋白质呈现一条分离带。 2.等电聚焦电泳，蛋白质呈现一条分离带。 3.纯化后，蛋白质应保留活性。 4.在超速离心场中，蛋白质以单一的沉降速度运动。 50 37 25 75 100 1 2 3 4 5 6 Mass (kDa) 蛋白分离纯化效果电泳示意图 二、多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的N端与C端氨基酸残基(Dansyl-氯法,羧肽酶法) 把肽链水解成片段 (胰蛋白酶法,胰凝乳蛋白酶法,溴化氰法) 测定各肽段的氨基酸排列顺序(Edman降解法) 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 (一)分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定他们的量，计算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或者个数。 (二)末端分析 1. N-末端测定 (1)2,4-二硝基氟苯（FDNB）法 (2)丹磺酰氯（DNS）法 优点：DNS试剂是荧光试剂，灵敏度高100倍。 FDNB法: 二硝基氟苯 二硝基苯AA Dansyl-氯法 2. C-末端测定: 羧肽酶法 羧肽酶A: 作用于除Arg，Lys，Pro和Hyp外的所有氨基酸（ C端倒数第二个是Pro时除外）。 羧肽酶B: 作用于Lys和Arg（C端倒数第二个是Pro时除外）。 （三）肽链的拆分 1.非共价键肽链拆分: 蛋白质变性剂。 2.二硫键的拆分 (1)还原法: 巯基化合物还原成巯基，再用碘乙酸乙酰化保护。 (2)氧化法： 过甲酸（HCOOOH） 二硫苏糖醇 二硫苏糖醇 碘乙酸 乙酰化 过甲酸 （四）肽链的部分水解和肽段的分离 1.溴化氰（CNBr）裂解法 : 专一水解Met的羧基端 3.胰凝乳蛋白酶法水解法: 水解芳香族氨基酸（Phe, Tyr, Trp） 2.胰蛋白酶（Trypsin）水解法: （五）肽段的氨基酸排列顺序的测定 以Edman降解法为基础的氨基酸人工或自动测序 苯乙内酰 硫脲丙氨酸 异硫氰酸苯酯 苯氨基硫甲酰基肽 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 三、蛋白质空间结构测定 * 二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而?-折叠的CD谱不很固定。 * 三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 * 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构 * 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。 1、同源建模，2、折叠识别，3、从无到有 　　　　　本章要求 1、名词：isoelectric point；motifs；domain; subunit；allosteric effect; protein denaturation; molecular disease；proteomics 2、结构层次 元素组成：C、H、O、N（16%）、S 结构单位：20种L-α氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等） 一级结构：肽键；多肽链；N端?C端 二级结构：稳定力（氢键）；类型（?螺旋，?折叠，?转角，无规卷曲） 三级结构特点、四级结构特点 3、重要性质